Das Blut übernimmt im Körper viele lebenswichtige Aufgaben, darunter den Sauerstoff- und Kohlendioxidtransport. Aber es transportiert auch Hormone, Nährstoffe, Exkretionsprodukte und ist am Wärmehaushalt und Immunsystem des Körpers beteiligt (Vorlesungsfolien).
Ca. 55% des Blutes nimmt das Plasma (Wasser, Proteine, Ionen, etc.) und 45% der Hämatokrit (zelluläre Bestandteile) ein. Der größte Anteil am Hämatokrit sind die Erythrozyten, roten Blutkörperchen, der Rest wird unter anderem aus den Leukozyten, bei der Immunabwehr beteiligt, und Thrombozyten, zuständig für die Blutgerinnung bei einer Verletzung, gebildet. Das Blutplasma kann nur sehr geringe Mengen gelösten Sauerstoff transportieren, mit denen die meisten Lebewesen nicht überlebensfähig wären.
Aber die Sauerstofftransportkapazität wird durch respiratorische Proteine, die Sauerstoff reversibel binden können, erhöht. Dadurch wird auch der Transport zwischen den respiratorischen Oberflächen (z.B. Lunge) und den Geweben erleichtert (Vorlesungsfolien und Purves).
Im Tierreich sind 3 Grundtypen der respiratorischen Transportproteine vorhanden, Hämocyanin, Hämerythrin und Hämoglobin (Abb.1), wobei beim Menschen nur das Hämoglobin diese Aufgaben übernimmt. Dadurch wird die Sauerstofftransportkapazität des Blutes um das ca. 60-fache erhöht und ermöglicht so eine höhere Stoffwechselintensität. Das Hämoglobin ist aus vier Polypeptiduntereinheiten, 2α- und 2β-Polypeptidketten, Abb.1 Aufbau eines Hämoglobins also ein Tetramer, aufgebaut, die jede von eisenhaltigen Ringstruktur, eine Hämgruppe, umgeben ist, die O2-Moleküle über das zentrale Eisenion reversibel binden kann.
Das heißt pro Hämoglobin können vier Sauerstoffmoleküle gebunden werden. Dabei handelt es sich um eine Oxygenierung und nicht um eine Oxidation, weil das Sauerstoff nur vorübergehend am Eisenion bindet und es keine Elektronenübertragung gibt. Deshalb spricht man auch bei der Freisetzung des O2 von einer Desoxygenierung und nicht von einer Reduktion (Purves).
An diesem Versuchstag wird mit Hilfe der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese die Molekülmasse des Hämoglobins einer Blutprobe ermittelt. Mit dem Molekulargewicht kann man dann die O2-Transportkapazität des Blutes bestimmen. Desweiteren wird in Versuch 2 die Hämoglobinkonzentration des Blutes ermittelt, die schwanken kann, z.B. ist die Konzentration bei Männern höher als bei Frauen, sowie auch bei Sportler im Gegensatz zu Untrainierten.
Im 3. Versuch wird die Erythrozytenzahl pro Liter bestimmt. Im 4. Versuch wurden die Blutgruppen (A/B/AB/0) der Kursteilnehmer bestimmt. Dazu wurde auf die Bindung der verschiedenen Antigene und Antikörper im Blut und die damit verbundene Agglutination (Verklumpung) zurückgegriffen.
2. Material und Methoden
Die Versuche wurden wie im Skript, „Tierphysiologisches Praktikum WS 2013/14“ beschrieben durchgeführt. Bei jedem Versuch, wo Eigenblut verwendet wurde, war es eine weibliche Testperson. Im folgendem die genauen Verdünnungen und Rechnungen der jeweiligen Versuche.
Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde wie von den Kursleitern beschrieben zusammen gebaut und mit SDS-Puffer befüllt. Danach wurde eine Verdünnungsreihe der Blutprobe wie folgt hergestellt: 1:2, 1:4, 1:8 und 1:16, das heißt es wurde immer 50 µl Probe abgenommen und 50 µl NaCl vermengt. Danach wurde von jeder Verdünnungsstufe 35 µl entnommen und mit 10 µl SDS-Lösung und 5 µl Bromphenol/Glyzerin-Lösung gemischt.
Danach wurde die wie folgt befüllt.
Tab.1 Befüllung der Taschen der SDS-PAGE
Danach wird die SDS-PAGE ca. 90 Minuten eingeschaltet, maximal bis das Bromphenolblau vor der unteren Kante des Gels befindet. Danach wird das Polyacrylamidgel wie im Skript weiterverarbeitet und ausgewertet.
2.2 Hämoglobinkonzentration des Blutes
Es empfiehlt sich die Konversionslösung in den jeweiligen Küvetten vorzulegen, bevor das Kapillarblut entnommen wird. Im Folgendem die genaue Angaben zum Befüllen der Küvetten:
Tab.2 Angaben zur Befüllung der Küvetten
Um die Hämoglobinkonzentration auszurechen wird folgende Rechnung benötigt: Hämoglobinkonzentration in g/l Blut = Extinktionswert bei 574nm × 349,6 g/l
Um die O2-Transportkapazität des Blutes auszurechnen braucht man folgende Werte und Rechnungen:
Zuerst rechnet man die Hämoglobinkonzentration durch die Molekülmasse eines Hämoglobins (in Versuch 1 ausgerechnet), dieser Wert ist noch nicht die O2-Transportkapazität:
Danach wird der Wert (x) noch einmal mit 4 multipliziert, da es pro Hämoglobin vier Hämgruppen gibt und danach nochmal mit 22,4L multipliziert, da ein Mol eines Gases ein Volumen von ca. 22,4L hat.
Um den Faktor zu errechnen dividiert man die errechnete O2-Transportkapazität durch 4, da 4ml Sauerstoff pro Liter Blutplasma physikalisch gelöst sind.
2.3 Erythrozytenzahl pro Liter Blut
Es werden 5 Mittelquadrate (s. Abb.2 und Abb.3) ausgezählt und ein Mittelwert gebildet.
Abb.2 Großquadrat von einer Zählkammer Abb.3 Beispiel für Mittelquadrate zum Auszählen
Das Volumen eines Großquadrates ist 0,004mm3, was sich aus der Fläche eines Kleinquadrates (0,0025mm2) und der Kammerhöhe (0,01mm) zusammensetzt. Hier nochmal veranschaulicht als Formel:
Wichtig: Später nicht die Verdünnung vergessen mit einzurechnen!
Um den MCH-Wert auszurechnen braucht man folgende Formel:
MCH (pg) =
2.4 Blutgruppenbestimmung (optional)
Bei der Blutgruppenbestimmung wurde die Tüpfelplatte entsprechend der Anweisungen im Skript präpariert und jeder Student hat sein eigenes Kapillarblut für den Test verwendet. In der nebenstehenden Abbildung (Abb.4) kann man erkennen, was bei den einzelnen Blutgruppen passieren würde, wenn das Blut mit dem Anti-Seren vermengt wird. Wobei die Punkte ( ) eine Verklumpung darstellen soll und der rote Fleck ( ) eine homogene Vermengung. Abb.4 „Schema der Blutgruppenbestimmung“
3. Ergebnisse
3.1 Molekülmasse des Hämoglobins
Die Molekülmasse des Hämoglobins wird mit der SDS-PAGE und Eichproteinen ermittelt. Bei den Eichproteinen ist die Molekülmasse bekannt und so kann sich an dieses orientiert werden. Als Hinweis, im Kurs wurde zuerst mit einem Literaturwert der Molekülmasse zum Rechnen verwendet, in diesem Protokoll werden aber nur die ermittelten Werte berücksichtigt.
Zur Erklärung: Links sind die Eichproteine zu sehen und die vier anderen Banden rechts sind die verschiedenen Verdünnungen der Blutprobe. Die Bande rechts neben den Eichproteinen wurde für die Rechnung verwendet.
Abb.5 Gelbbild
Die Eichproteine wurden als Anhaltspunkte in eine Tabelle (Tab.3) eingetragen, eine Ausgleichsgerade gezogen und dann wurden die Lauflängen-Werte der 1.–3. Bande (Tab.4) hinzugefügt und die Molekülmassen abgelesen (Anhang 1).
Tab.4 Banden und Lauflängen Tab.3 Eichproteine: Masse und Lauflängen
Durch den Vergleich zwischen ermitteltem Molekulargewicht und Literaturwert eines nativen Hämoglobins, konnte angenommen werden, dass die obere Bande Dimere und die untere Bande Monomere darstellt.
3.2 Hämoglobinkonzentration des Blutes
Für den Versuch wurde einer weiblichen Versuchsperson Blut abgenommen. Dann wurde mit Hilfe eines Fotometers die Extinktionen eines Leerwertes, einer Kontrolle low und einer Kontrolle high und einer Blutprobe ermittelt, wobei der Leerwert außeracht gelassen werden kann. Im nachfolgendem eine Tabelle (Tab. 5) zur Übersicht:
Tab.5 Ãœbersicht der ermittelten Extinktionswerte
Um die Hämoglobinkonzentration zu errechnen, wird nur der gemessene Extinktionswert für die Blutprobe eingesetzt:
Der eben ausgerechnete Wert der Hämoglobinkonzentration wird nun weiter verwendet, um die O2-Transportkapazität zu ermitteln, indem der Wert durch die Molekülmasse eines Hämoglobins (ausgerechnet in V.1) geteilt wird:
Und zum Schluss noch mit 22,4Lmultiplizieren, da ein Mol eines Gases ein Volumen vin ca. 22,4 L hat:, das entspricht
Also kann 1 Liter Blut 143ml O2 transportieren.
Um den Faktor auszurechen, wie viel mehr Sauerstoff mit Hilfe des Hämoglobins transportiert werden kann dividiert man die eben Wert durch 4 (Erklärung in Material und Methoden):. Das heißt durch das Hämoglobin kann das fast 36-fache an Sauerstoff mit dem Hämoglobin transportieren.
Die durchschnittliche Hämoglobinkonzentration bei Frauen in unserem Kurs betrugund bei den Männern. Der Wert unserer weiblichen Versuchsperson liegt etwas unter dem Durchschnitt (Anhang 2).
3.3 Erythrozytenzahl pro Liter Blut
Tab.3 Ergebnisse der Auszählung der Mittelquadrate
Der Mittelwert der fünf Quadrate ist 149 Erythrozyten (in den Rechnungen mit E abgekürzt!) auf 0,004 mm3. Es gibt verschiedene Möglichkeiten auf die Erythrozytenzahl in einem Liter Blut zu kommen, hier wird es mit einem einfachen Dreisatz gerechnet:
Da mm3 gleichzusetzen ist mit µl, hat man 149 Erythrozyten in 0,004µl Blut. Es soll aber für einen Liter gerechnet werden, daher wird erstmal die Erythrozytenanzahl für 1 µl errechnet. Dafür multipliziert man die ermittelten 149 Erythrozyten mit 250 (da 0,004 µl×250=1 µl):
Ausgerechnet wurde 37258 Erythrozyten in 1µl Blutverdünnung. Nun wird noch die Verdünnung (1:100) eingerechnet:
Die Versuchsperson hat also 3,725×1012 Erythrozyten in einem Liter Blut.
3.4 Blutgruppenbestimmung (optional)
In jede Vertiefung wurde ein Tropfen Kapillarblut und Testseren gegeben. Bei 2 von 3 Personen unserer Gruppe hatten sich keine Verklumpungen gebildet, was darauf schließen lässt, dass diese Personen Blutgruppe 0 haben. Bei der letzten Person hatten sich Verklumpungen bei Antikörper-B und Antikörper-AB gebildet, daher hat diese Person die Blutgruppe B.
Für die ganze Gruppe hat sich folgende Aufteilung ergeben (siehe auch Abb.6): Von 18 Personen haben 9 Personen, also 50%, haben die Blutgruppe A. Die Blutgruppe B ist mit 3 Personen (16,7%) und die Blutgruppe 0 mit 5 Personen (27,8%) vertreten. Die seltenste Abb.6 Gruppenübersicht für die Blutgruppen
4. Diskussion
4.1 Molekülmasse des Hämoglobins
Die berechnete Molekülmasse des Hämoglobins mit 80kDa und das Molekulargewicht einer Hämoglobinkette mit 20kDa weicht etwas von dem Literaturwert 64kDa bzw. 16kDa (Anhang 2) ab. Der Durchschnitt des Kurses mit 72kDa bzw. 18 kDa ist annähernd in dem Bereich. Eine mögliche Erklärung könnten Fehler bei den Messungen sein. Da man die Werte aus einer manuell gezeichneten Ausgleichsgerade abgelesen hat, kann es schon zu großen Schwankungen und dadurch zu Fehlern kommen.
Der Literaturwert bezieht sich auf das menschliche Hämoglobin, da es eine unbekannte Blutprobe war, könnte es auch von einem anderen Lebewesen gewesen sein.
Anstelle der erwarteten einzelnen Banden wurden starke und schwächere Banden sichtbar. Die starken Banden sind die Hämoglobin-Monomere und die schwächeren Banden die Dimere. Das SDS spaltet zwar das Hamöglobin in Monomere, aber es kann teilweise zu Rückreaktionen kommen.
4.2 Hämoglobinkonzentration des Blutes
Die Hämoglobinkonzentration der weiblichen Versuchspersonist zwar niedriger als der Kursdurchschnitt (), aber immer noch im Normbereich ((Anhang2). Wie auch bei der Erythrozytenzahl kann auch die Hämoglobinkonzentration von Geschlecht zu Geschlecht und von Mensch zu Mensch schwanken. Der Unterschied bei Männern und Frauen kommt daher, dass Männer prozentual mehr Muskelmasse haben als Frauen.
Aber Vorsicht ist geboten, denn auch das bekannte Dopingmittel Erythropoetin (besser bekannt als EPO) ruft diesen Vorgang hervor und daher gibt es bestimmte Grenzen die nicht überschritten werden dürfen. Aber was nur wenige Menschen wissen ist, dass das Mittel auch in der Medizin eingesetzt wird, um wirklich kranke Menschen zu helfen und therapieren.
In der Medizin ist es sehr wichtig zu wissen wie die Hämoglobinkonzentration im Blut eines Menschen ist. Zeigen sich Auffälligkeiten, wie z.B. eine zu niedrige Konzentration kann das auf eine Anämie hinweisen. Der Patient leidet dann häufig an Luftknappheit auch bei nur leichter Anstrengung und schnellere Ermüdung. Um das zu bestätigen wird der MCH-Wert bestimmt (Versuch 3).
Ohne diese Proteine würden die meisten Tiere nicht lebensfähig oder nur sehr eingeschränkt lebensfähig sein, d.h. das Leben was heute existiert wäre nicht vorhanden. Die Proteine transportieren den Sauerstoff in alle Teile des Organismus, so können z.B. Muskeln und Organe effizienter arbeiten.
4.3 Erythrozytenzahl pro Liter Blut
Die Erythrozytenzahl kann von Mensch zu Mensch und auch von Geschlecht zu Geschlecht stark schwanken. Im Allgemeinen sagt man, dass bei Männern zwischen 4,5 bis 5,9×1012 pro Liter Blut und bei Frauen 4,1 bis 5,1×1012 pro Liter Blut der Normbereich liege (umgerechnet aus der Apotheken Umschau aktualisiert 28.05.2013). Unsere Versuchsperson liegt mit 3,725×1012 pro Liter Blut etwas drunter.
Tierphysiologisches Praktikum Protokoll vom 18.11.08 Exkretion 1. Einleitung Unter der Exkretion versteht man das Entfernen von nicht mehr verwertbaren Stoffwechselprodukten aus dem Stoffwechselkreislauf. Der Begriff Exkretion kommt aus dem lateinischem von: externere und…
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