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RFLP als Modell für einen DNA-Fingerprint

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Protocol
Biology

University, School

Gymnasium Ulm

Grade, Teacher, Year

15, 2016

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Ausarbeitung zum zweiten Unterrichtsbesu­ch im Ausbildungsfach Biologie Wie ist die DNA aufgebaut? - Wir bauen ein Modell! Datum: 18.09.2017 Zeit: 12.15 Uhr bis 13.00 Uhr (6.Stunde) Ort: Schulform: Höhere Berufsfachschul­e Fachrichtung Organisation und Officemanagemen­t Schulinterne Bezeichnung der Klasse: HB17O Raum: B210 Eingeladen sind: Fachleitung Biologie BP-Fachleitung Schulleitung Mentor Ausbildungsschu­le: Ausgearbeitet von: Inhaltsverzeich­nis Rahmenbedingung­en 2 Schulische und unterrichtliche Rahmenbedingung­en…
Inklusive Lehrerausbildun­g – Das finnische Modell als Vorbild für das Deutsche Inhaltsverzeich­nis Einleitung Empfehlung des Europäischen Parlaments Vorgehen bei der Analyse der Lehrerausbildun­g Deutschlands und Finnland Lehrerausbildun­g in Deutschland Stärken und Schwächen Erste, universitäre Phase Zweite, berufsfeldorien­tie­rte Phase Zulassungsvorau­sse­tzungen Berufseinstieg Inklusion Rahmenbedingung­en Finnlands Geographische, klimatische und gesellschaftlic­he Verhältnisse Stellenwert von…

RFLP als Modell für einen DNA-Fingerprint

Protokoll über den am 13.04.2016

abgeleisteten Versuch am Albert Einstein Gymnasium


1. Einleitung/Theorieteil


Der genetische Fingerabdruck (ebenso "DNA-Profil" oder "DNA-Fingerprinting") ist seit Mitte der 80er Jahre ein wirksames Mittel für die Strafverfolgungsbehörden zur eindeutigen Identifizierung einer Person in der Hand.
In kriminaltechnischen oder auch forensischen Laboratorien werden genetische Fingerabdrücke untersucht, um die Schuld oder auch Unschuld eines verdächtigen Täters mit denen am Tatort gefundenen Spuren zu ermöglichen.

Ebenso wird der genetische Fingerabdruck oft bei Vaterschaftstests und anderen Problemen, die mit der Herkunft von genetischen Material zu tun haben, verwendet.

Die Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Methode (kurz RFLP-Methode) ist ein Verfahren, welches zur Gewinnung einzelner DNA Stücke aus der Gesamt DNA dient. Im Gegensatz zum PCR-Verfahren, welches bei einer kleinen winzigen Menge an DNA Material angewandt wird, benötigt die RFLP Methode genügend DNA Material (mind. 50.000 bis 500.000 Zellkerne).

Die Wiederholungssequenzen können anhand von spezifischen Schneide-Enzymen, den sogenannten Restriktionsenzymen, erkannt und an ihren Erkennungssequenzen geschnitten werden. Darauf erhält man verschieden lange DNA-Fragmente. Der nächste Schritt ist die Elektrophorese.

Sie dient dazu die Fragmente nach ihrer Größe zu sortieren. Diese werden auf ein Gel in einem elektrischen Feld aufgelagert. DNA Stücke sind aufgrund ihrer Phosphat-Gruppe negativ geladen und wandern in Richtung des Plus Pols. Größere Fragmente wandern dabei langsamer als kleinere.

Zum Schluss werden die einzelnen Abschnitte sichtbar gemacht. Durch Auflegen eines Röntgenfilms ist es möglich die Fragmente, sowie ihre Länge aufzuzeigen. Es entsteht nun ein Bandenmuster, welches den genetischen Fingerabdruck aufzeigt.


Prinzip: Wie funktioniert es beim Menschen?


Beispiel:


-Person 1 hat eine Schnittstelle eines Restriktionsenzyms, Person 2 dagegen nicht


-Wenn Sequenzen mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden:

> bei Person 1: zwei Fragmente > bei Person 2: ein ein Fragment


-Bei Vergleich der Sequenzlängen kann ein .....[read full text]

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Bei diesen Vorgängen kann man wenn man einen Stoff in alle Gefäße verteilt mit der selben Spitze arbeiten, dagegen benötigt man eine Neue wenn ein neuer Stoff an der Reihe ist. Somit können mögliche Vermischungen vermieden werden. Beim nächsten Schritt muss man alle Ansätze in den Gefäßen zumachen und diese im Vortexmischer gut durchmischen.

Anschließend muss man die selben Gefäße für eine kurze Zeit (ca. 10 sek) in der Tischzentrifuge abzentrifugieren und diese bei 37 Grad Celsius im Wasserbad für 30 Minuten inkubieren.



Teil 2: Agarosegelelektrophorese


Der zweite Teil des Versuches ist die Agarosegelelektrophorese. Die Agarosegelelektrophorese ist eine biochemische und molekularbiologische Methode, in der DNA-Stränge (oder auch RNA) durch eine Gelelektrophorese nach ihrer Größe getrennt werden, um ihre Größe durch Vergleich mit DNA-Strängen bekannter Größe zu ermitteln. Dieser Teil benötigt 360 mg Agarose in einem 30 ml TBE-Puffer, eine Mikrowelle, eine Schutzbrille, Lederhandschuhe und eine Elektrophorese-Apparatur (Gelkammer + Kamm).

Um ein Agarose Gel herzustellen muss man zunächst die 360 mg Agrosemit dem TBE-Puffer mischen und anschließend in der Mikrowelle aufkochen, bis eine klare Lösung entsteht. Das macht man zwei mal kurz bei jeweils 600 W. Hier gilt zu beachten, dass eine Schutzbrille sowie Lederhandschuhe getragen werden müssen, da es sich um eine siedende Flüssigkeit handelt.

Die Agarose muss man darauf bei Zimmertemperatur auf ca. 60 Grad Celsius abkühlen lassen. Hier gilt zu beachten, dass man die Agarose nicht mit kaltem Wasser abkühlen darf. In der Zwischenzeit wird die Elektrophorese-Apparatur zusammen gebaut. Danach wird das Gel in d.....

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Beim Pipettieren muss man darauf achten, dass man das Gel mit der Pipettenspitze nicht beschädigt. Beim Herausziehen der Pipette muss der Druckknopf gehalten werden. Nachdem alle nötigen Proben in den Taschen des Gels hineinpipettiert wurden wird die Gelkammer an eine Spannungsquelle angeschlossen.

Hier muss man die plus/minus Pole beachten. Nun wird eine Gleichspannung von 120 V angelegt. Darauf wird mit der Taste RUNder Elektrophorese-Apparatur die Elektrophorese gestartet. Die Elektrophorese dauert solange bis der blaue Farbstoff 1 cm vor dem unteren Ende an den Pluspol des Agrosegels gewandert ist.

Die sich im Gel befindende DNA ist negativ geladen, also verläuft diese in Richtung des Plus Pols. Danach kann der Strom abgestellt werden.


Teil 4: Färben des Gels und Auswertung


Der vierte und letzte Schritt befasst sich mit dem Färben des Gels und anschließender Auswertung. Benötigt werden für diesen Teilschritt der Farbstoff Ethidiumbromid, ein Schlitten, eine Färbeschüssel und ein speziellen Apparat: Gel-Doku(UV-Licht), welcher zur Dokumentation der Ergebnisse dient.

Nachdem die Stromquelle abgestellt wurde wird das Gel vorsichtig mit dem Schlitten herausgenommen und in die Färbeschale gelegt. In der Schale wird das Gel dann mit Ethidiumbromid gefärbt. Das ist ein Farbstoff, der in der Molekularbiologie unter anderem oft zum Nachweis der DNA verwendet wird.

Am Besten merkt man sich auch die Position des Gels. Nach der ca. 10 minütigen Färbung des Agrosegels kann es nun in einem speziellen Apparat, der mit UV-Licht arbeitet, abfotografiert werden. Die Gele können nun digitalisiert werden; das könnte folgendermaßen aussehen:





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Hier wurde möglicherweise unvorsichtig gearbeitet.

Bei Gruppe 2 sieht die Aufnahme sehr verwischt aus und hat ähnlich mögliche Stichstellen, wie bei Gruppe 1 (wenn auch kleiner). Hier wurde wahrscheinlich ebenso unsauber gearbeitet. Gruppe 3 stellt so gut wie kein Ergebnis dar. Hier kann gesagt werden, dass das Gel beim Herausnehmen zerbrach, weil es zum Beispiel nicht vollständig ausgehärtet war oder man nicht vorsichtig genug war.

Abschließend kann gesagt werden, dass das RFLP-Verfahren für Kriminologen eine sehr gute Möglichkeit bietet Tatverdächtige zu überführen. Jedoch ist es für Personen, die mit der Materie nicht allzu vertraut sind schwierig alles beim ersten Mal erfolgreich umzusetzen.

Bei unserem Klassenversuch war das auch der Grund für die sämtlichen Fehler. Ebenso ist beim Pipettieren eine enorme Genauigkeit und Ruhe gefordert, was für viele Schüler eine Schwier.....


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