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Laborbericht
Biowissenschaften

Ruhr-Universität Bochum - RUB

2017

Jasmin K. ©
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sternsternsternsternstern
ID# 70065







PRAKTIKUM BIOCHEMISCHE

ARBEITSTECHNIKEN


PROTOKOLL ZUR ISOLIERUNG

DES GLYKOGENS

AUS DEM LEBER


Einleitung:


Das Glykogen ist ein verzweigtes Polysaccharid, das aus Glucose-Einheiten aufgebaut ist.1Glykogen besteht aus einem zentralen Protein (Glykogenin), an das bis zu 50.000 Glucosebausteine meist α-1,4- glykosidisch geknüpft sind. Alle 8 bis 12 Glucose-/Monosaccharid-Bausteine erfolgt neben der α-1,4-glykosidischen Bindung eine weitere α-1,6-glykosidische Verknüpfung, wodurch das Molekül baumartig verzweigt wird (Abb.1).

So kann bei Bedarf an vielen verschiedenen Stellen innerhalb eines Moleküls Glykogen zu Glucose abgebaut werden.1

Glykogen dient der Speicherung und Bereitstellung des Kohlenhydraten in den menschlichen und tierischen Organismen. Glykogen wird in den Leber- und Muskelzellen in Form von zytosolischer Granula gespeichert.

Glykogen hat eine globuläre Form mit der Molekülmasse von 1 x 106 bis zu 20 x 106 Da und einer molaren Masse von 106 bis 107 Dalton und bis zu 120.000 Glukoseeinheiten.1 Der Durchmesser des Partikel-bindenden Makromoleküls beträgt 20-200 nm, die auf- und abbauende Enzyme, Synthase und Phosphorylase sind an die Glykogenpartikel gebunden.2

In der Granula befinden sich die Enzyme zur Spaltung des Polymers in seine Monomere. Um die gespeicherte Energie wieder erreichbar zu machen, wird Glykogen durch das Enzym Glykogen-Phosphorylase in die Glukosemonomere abgebaut. Dieses spaltet die 1→4- Bindungen im Glykogen.

Die stark verzweigte Struktur mit vielen freien Enden macht eine sehr schnelle Freisetzung von Glukose in den verbrauchenden Zellen bei erhöhtem Bedarf möglich.

Mit der Nahrung aufgenommene Stärke wird durch das Enzym alpha-Amylase im Mund und im Zwölffingerdarm in die beiden Disaccharide Maltose und Isomaltose gespalten, welche wiederum durch weitere Enzyme schließlich in Glucose überführt werden.

Die Muskeln nutzen ihren Glykogenvorrat ausschließlich selbst, die Leber und die Nieren dienen als Glykogenspeicher und stellen es hauptsächlich anderen Zellen zur Verfügung. Dies ist vor allem im Schlafzustand als Energieversorgung für Zellen des Nebennierenmarks und Erythrozyten wichtig, da diese Zellen auf Glucose als Energielieferant angewiesen sind.

Der Blutzuckerspiegel wird unter anderem mittels Glykogenauf- und -abbau durch verschiedene Hormone reguliert: Adrenalin und Glucagon regen den Glykogenabbau an, Insulin fördert den Glykogenaufbau. Insulin und Glucagon werden in Teilen der Bauchspeicheldrüse gebildet.

Der Glykogengehalt der Leber variiert dabei je nach Ernährungszustand des menschlichen Körpers. Im Hungerzustand beträgt er weniger als 1 % des Lebergewichtes. Bei gutem Ernährungszustand und kohlenhydratreicher Kost kann er auf bis zu 20 % des Lebergewichtes anwachsen.

Pro Gramm Gewebe gerechnet ist die Glykogen-Kapazität der Nieren höher als die der Leber. Da die Leber aber das deutlich größere Organ ist, ist die absolute Kapazität der Leber höher.


Abb. 1 - Die Struktur von Glykogen (Voet/Voet – Biochemie S. 452)


3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS oder 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure) (Abb.2) ist eine Phenolsäure, die mit reduzierenden Zuckern oder anderen reduzierenden Molekülen eine typische Farbreaktion gibt. Man verwendet sie zur quantitativen Bestimmung von reduzierenden Zuckern. Die Nitrogruppe der 3,5-DNS wird durch den Zucker zu 3-Amino-5-Nitrosalicylsäure reduziert, der Zucker wird dabei oxidiert.

Bei dieser Reaktion schlägt die Farbe der Lösung von orangegelb nach rot um. Die Reaktion läuft unter Erhitzen in alkalischer Lösung ab, die Extinktionen der Lösungen können bei 536 nm gemessen werden.


Abb.2 - 3,5-Dinitrosalicylsäure ( äure)


Abb.3 – Reduktion von 3,5-Dinitrosalicylsäure (


Durchführung:


  1. Isolierung von Glykogen.

Es wurden 10,86 g gefrorene Schweineleber abgewogen und mit einem Skalpell in kleine Stücke geschnitten. Die Leberstücke wurden in einen kalten Mörser überführt und mit etwas Sand und 10 ml 10%ger Trichloressigsäure (TCA) zerrieben, bis die Mischung homogen geworden wurde.

Anschließend wurden langsam unter Rühren 2 Volumen 95%iges Ethanol hinzugegeben und das Gemisch wurde bis zum Ausflocken stehen gelassen. Danach wurde die Suspension wieder 5 min bei 2000 g zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Sediment wurde in 5 ml Wasser gelöst.

Unter Rühren wurden zu der Lösung 10 mL 95%ges Ethanol gegeben, die Lösung wurde wieder zentrifugiert. Der Niederschlag wurde zweimal mit 3 mL 95%igem Ethanol und einmal mit 3 mL Diethylether gewaschen und nach jedem Waschschritt wurde die Lösung abzentrifugiert.

Der Rückstand wurde anschließend an der Luft getrocknet und danach abgewogen.


  1. Saure Hydrolyse.

Für die saure Hydrolyse wurden 160 mg Glykogen abgewogen und in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. 8


Tabelle 1: Pipettierschema zur sauren Hydrolyse


Ansatznummer

1

2

3

4

5

6

7

8











0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

1.Vorgelegt

d. H2O

Glykogen-

Glykogen-

Glykogen-

Glykogen-

Glykogen-

Glykogen-

Glykogen-



Lsg.

Lsg.

Lsg.

Lsg.

Lsg.

Lsg.

Lsg.




















0,6 ml

0,6 ml 2N

0,6 ml 2N

0,6 ml 2N

0,6 ml 2N

0,6 ml 2N

0,6 ml 2N

0,6 ml 2N

2.Zugegeben

2M HCl

HCl

HCl

HCl

HCl

HCl

HCl

HCl











3.Reaktions-

0 min

0 min

3 min bei

6 min bei

9 min bei

12 min

15 min

25 min

zeit



95°C

95°C

95°C

bei 95°C

bei 95°C

bei 95°C











1 ml

1 ml 1,2M

1 ml 1,2M

1 ml 1,2M

1 ml 1,2M

1 ml 1,2M

1 ml 1,2M

1 ml 1,2M

4. Zugegeben

1,2M

NaOH +

NaOH +

NaOH +

NaOH +

NaOH +

NaOH +

NaOH +


NaOH +

1ml 3,5-

1ml 3,5-

1ml 3,5-

1ml 3,5-

1ml 3,5-

1ml 3,5-

1ml 3,5-


1ml 3,5-

DNS

DNS

DNS

DNS

DNS

DNS

DNS


DNS








5.Abkühlung

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

6.Zugegeben

10 ml H2O

10 ml H2O

10 ml H2O

10 ml H2O

10 ml H2O

10 ml H2O

10 ml H2O

10 ml H2O

Nach der Zugabe von 10 mL Wasser wurde die Lösung mit Parafilm gemischt.

1 ml von jeder Lösung wurden in Küvetten überführt. Die Extinktion wurde bei 536 nm im Photometer gemessen.


  1. Enzymatische Hydrolyse

Für die enzymatische Hydrolyse wurden 160 mg Glykogen in 20 ml Phosphatpuffer gelöst. Außerdem wurde etwa 1 ml Speichel mit 40 ml destilliertem Wasser verdünnt und

gemischt. Die Lösungen wurden nach folgendem Schema zusammen pipettiert:


Tabelle 2: Pipettierschema zur enzymatischen Hydrolyse


Ansatznummer

1

2

3

4

5

6

7










0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml

0,4 ml


d.H2O

Glykogen-

Glykogen-

Glykogen-

Glykogen-

Glykogen-

Glykogen-

1.Vorgelegt


Lsg.

Lsg.

Lsg.

Lsg.

Lsg.

Lsg.


















0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

2.Zugegeben

Speichel

Speichel

Speichel

Speichel

Speichel

Speichel

Speichel









3.Reaktions-

0 min bei RT

3 min bei RT

6 min bei

RT

9 min bei

RT

12 min bei RT

15 min bei RT


25 min bei RT

zeit

















1 ml 3,5-

1 ml 3,5-

1 ml 3,5-

1 ml 3,5-

1 ml 3,5-

1 ml 3,5-

1 ml 3,5-

4.Zugegeben

DNS

DNS

DNS

DNS

DNS

DNS

DNS









5.Erhitzung

5 min 95 °C

5 min 95 °C

5 min 95 °C

5 min 95 °C

5 min 95 °C

5 min 95 °C

5 min 95 °C

6.Abkühlung

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

Abgekühlt auf RT

7.Zugegeben

10 ml dH2O

10 ml dH2O

10 ml dH2O

10 ml dH2O

10 ml dH2O

10 ml dH2O

10 ml dH2O

Nach der Zugabe von 10 ml Wasser wurde die Lösung mit Parafilm durchgemischt. 1 ml von jeder Lösung wurden Küvetten überführt. Die Extinktion wurde bei 536 nm im Photometer gemessen.




  1. Tabelle 3: Gewichte von Leber und Glykogen und Massenanteil


Gruppe

Lebergewicht [g]

Glykogengewicht [g]

Massenanteil %





A

10,86

0,314

2,89





B

11,55

0,773

6,69





C

12,19

0,046

0,37





D

10,13

0,099

0,97


Aus 10,86 g Leber konnten 314 mg (0,314 g) Glykogen isoliert werden. Das entspricht einem Massenanteil von 2,89 %. Den Massenanteil berechnet man wie folgt:

(Glykogengewicht / Lebergewicht) x 100 %


  1. Tabelle 4: Extinktionswerte von Glykogen bei der sauren Hydrolyse


Der Ansatz der sauren Hydrolyse mit 25 Minuten Reaktionszeit (Ansatz 8) wurde als Wert für den Hydrolysegrad 100% genommen. Der Hydrolysegrad 0 % entspricht dem Leerwert 0.

Der Hydrolysegrad berechnet man wie folgt : (Extinktion / Extinktion von Ansatz 8) x 100 %


Ansatznummer

Extinktion

Hydrolysegrad

1

0 (Leerwert)

0%

2

0,033

4,27%

3

0,143

18,5%

4

0,356

46,1%

5

0,465

60,2%

6

0,577

74,7%

7

0,701

90,8%

8

0,772

100%

  1. Tabelle 5: Extinktionswerte von Glykogen bei der enzymatischen Hydrolyse


Ansatznummer

Extinktion

Hydrolysegrad

1

0

0%

2

0,120

15,5%

3

0,244

31,6%

4

0,282

36,6%

5

0,353

45,75

6

0,370

47,9%

7

0,471

61,01%



In dem Diagramm ist der zeitliche Verlauf der sauren und enzymatischen Hydrolyse von Glykogen dargestellt.

Die farbigen Punkten bezeichnen den realen Verlauf des Hydrolysegrads, die schwarzen

Linien sind die Trendlinien, sie bezeichnen den Zusammenhang zwischen Zeit und Hydrolyseverlauf. Bei der sauren Hydrolyse handelt es sich um einen linearen Zusammenhang zwischen Reaktionszeit und Hydrolysegrad, bei der enzymatischen Hydrolyse handelt es sich um einen logarithmischen Zusammenhang.


Diskussion:


In dem Ansatz von unserer Gruppe (A) wurden aus 10,86 g Leber 314 mg Glykogen isoliert, das entspricht einem Gewichtsanteil von 2,9 %. Der Wert ist relativ gering im Vergleich zur Gruppe B (ca. 6,7%), aber relativ hoch im Verhältnis zu den restlichen ermittelten Werten (bis ca. 1 %).

Außerdem könnten Fehler beim Pippetieren gemacht worden.

Im Vergleich zu den Literaturwert 7% (Lehninger – Principles of Biochemistry 1975 Bande 2, S. 231) ist der von uns erhaltene Wert zu niedrig.


Von dem Hydrolysegrad wurde es erwartet, dass er proportional erhöht musste, der Hydrolysegrad ist zwar zunehmend, aber er erhöht sich nicht proportional, sondern flacht mit der Zeit ab und nähert sich zu einem Grenzwert. Daraus folgt, dass der Hydrolysegrad von 100 % hier nicht erreicht werden kann, egal wie lange die Reaktion läuft.


Literaturverzeichnis:

  • Praktikumsskript

  • Voet/Voet - Lehrbuch der Biochemie, 2002

  • Löffler – Biochemie und Pathobiochemie, 8 Auflage

  • K. Jungermann, H. Möhler - Biochemie: Ein Lehrbuch für Studierende der Medizin, Biologie und Pharmazie (2013)

  • Lehninger – Principles of Biochemistry, 1975

  • 1 

    2 K. Jungermann, H. Möhler - Biochemie: Ein Lehrbuch für Studierende der Medizin, Biologie und Pharmazie (2013) S. 182


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