Finde mit Hilfe einer Dünnschichttomographie heraus, welche zwei Aminosäuren in dem Gemisch enthalten sind.

Aufbau:

Für die Chromatographiekammer sollten wir 24ml Lösung aus Butanol, Essigsäure und destilliertem Wasser. Das Verhältnis beträgt 4:1:1, 4 mal Butanol, einmal Essigsäure und einmal destilliertes Wasser. Da das Gemisch aus 24ml bestehen soll, muss man also 16ml Butanol, 4ml Essigsäure und 4ml destilliertes Wasser mischen.

Versuchsdurchführung:

Als allererstes haben wir die Lösung im entsprechenden Mischverhältnis, welche an der Chromatographiekarte hoch läuft, hergestellt und in die Chromatographiekammer gefüllt.

Als nächstes nahmen wir eine Chromatographiekarte und malten mit einem Bleistift eine Startlinie auf die Chromatographiekarte, worauf anschließend die Aminosäuren in gleichmäßigem Abstand, sodass sich die Aminosäuren nicht berühren und im Verlauf des Experiments nicht in die Quere kommen. Wenn man die Karte in die Chromatographiekammer stellt, muss die Startlinie ein klein wenig höher als das Laufmittel sein, um Verfälschungen zu vermeiden. Wichtig bei dem Auftragen der Aminosäuren und weiteren Schritten mit der Chromatographiekarte ist, dass man nicht die Fläche der Karte berührt, denn sonst würde man Eiweiß Spuren hinterlassen.

Die Aminosäuren wurden mit Kapillarpipetten vorsichtig in gleich großen Tropfen auf die Startlinie getupft. Um auch hier keine Verfälschungen entstehen zu lassen, werden für jede Aminosäure eigene Kapillarpipetten verwendet und nach der Benutzung weg geworfen.

Nun wird die Chromatographiekarte in die Chromatographiekammer gestellt, und mit einem Deckel geschlossen.

Nach etwa einer Stunde nahmen wir die Chromatographiekarte wieder heraus und markierten, wie hoch das Laufmittel gelaufen ist. Als nächstes föhnt man die Karte trocken und bespritzt sie mit dem Mittel Ninhydrin. Daraufhin föhnten wir die Karte noch einmal. Mit der Zeit konnte man beobachten wie sich die Chromatographiekarte an manchen Stellen verfärbte.

Ergebnis:

Skizze:

Gly = Glycin

Asp = Asparaginsäure

Cys = Cystein

Gem = Gemisch

Nach dem Trockenföhnen der Chromatographiekarte, konnte man vier Laufbahnen auf der Karte erkennen

Wie man in der Skizze sehen kann ist Cystein in der Stunde am höchsten gelaufen. Glycin und das Gemisch sind ziemlich gleich auf. Am niedrigsten ist auf der Chromatographiekarte die Asparaginsäure. Man kann nur einen kleinen rosafarbenen Punkt.

Wenn man die Verfärbung genau anschaut, kann man erkennen, dass das Gemisch dem Glycin sehr ähnelt, fast identisch. Daraus kann man schließen, das in dem Gemisch auf jeden Fall Glycin enthalten ist. Außerdem muss die Asparaginsäure enthalten sein, denn Cystein ist viel zu hoch mit der Laufflüssigkeit gestiegen, hingegen die Asparaginsäure nur ein klein sehr wenig von der Startlinie aus und dadurch im Gemisch wenig Einfluss auf die Laufhöhe hat und dadurch das Gemisch mit dem Glycin gleich auf ist und auch noch sehr ähnlich aussieht.

Auswertung:

Die Dünnschichtchromatographie ist ein chemisch-physikalisches Analyseverfahren. Mit dem Verfahren kann man die Zusammensetzung von Proben bestimmen. Es ist ein schnelles Verfahren und kann mit wenig Aufwand betrieben werden.

Auf der Chromatographiekarte befindet sich eine Trennschicht, welche gleichmäßig und fein auf eine Trägerplatte verteilt wird. Die Trennschicht wird Stationäre Phase genannt und kann aus verschiedenen Materialien bestehen, wie zum Beispiel Kieselgel, Aluminiumoxid, Cellulose und weitere. Unsere Stationäre Phase besteht aus einem Silicat.

Die Chromatographiekarte wird in das Laufmittel gesellt, welches auch als mobile Phase bekannt ist. Die Zusammensetzung unserer mobilen Phase besteht aus Butanol, Essigsäure und destilliertem Wasser, wie auch schon zu Beginn beschrieben.

Prinzip der Dünnschichtchromatographie:

Die Chromatographiekarte wird in das Laufmittel gestellt. So kann das Laufmittel an dem feinporigen, festen Trägermaterial durch Kapillarkräfte nach oben wandern. Die Teilchen müssen sehr schnell von einer Phase in die nächste Wandern und wieder zurück. Durch das Chromatographie Verfahren kann man so den Austauschvorgang der Teilchensorten zwischen den Phasen in unterschiedliche Geschwindigkeiten umwandeln. Erkennen kann man diese anhand der Chromatographiekarte, auf der man sieht welche Substanz in einer bestimmten Zeit eine bestimmte Strecke zurück gelegt hat, und diese kann man mit anderen Substanzen vergleichen und daraus schließen welche Substanzen in einem Gemisch enthalten sind. Substanzen mit hoher Polarität bewegen sich langsamer als Substanzen mit niedrigerer Polarität. Am schnellsten sind Substanzen mit gleicher Polarität der mobilen Phase.

Das Silikat auf unseren Chromatographiekarten ist unpolar, hingegen dazu besteht die mobile Phase aus Essigsäure, welche stark polar ist, Wasser ebenfalls polar und das Butanol auch leicht polar. Also müssten Aminosäuren welche sehr stark polar oder unpolar sind am langsamsten wandern. Die Aminosäuren welche die gleiche Polarität als unsere mobile Phase hat, sollte am schnellsten nach oben wandern. Je größer der Unterschied der Polarität wird, je langsamer wird die Aminosäure. Die mobile Phase ist leicht sauer, mit einem pH-Wert von 5.

Asparaginsäure

IEP 2,8

Die Asparaginsäure besitzt laut Titrationskurve drei pKs-Werte, was bedeutet, dass sie drei Protonen als Kation abgeben kann.

Als erstes werden die Protonen der Carboxylgruppen abgegeben, wodurch sich die Polarität aufhebt, da sich die Carboxylgruppen gegenüber befinden.

Durch diese schwache Polarität wandert die Asparaginsäure langsamer auf der Chromatographiekarte.

Glycin

IEP : 6,0

Da der IEP bei 6 liegt, ist das Glycin nur teilweise als Kation vorliegt. In der unteren relativen Konzentrationskurve kann man sehen das das Gleichgewicht der Glycin-Ionen fast komplett auf Seite der Zwitterionen liegt bei einem pH-Wert von 5. Das Glycin besitzt als Rest ein H-Atom, woraus man schließen kann, dass eine starke Polarität entsteht.

Da das Glycin stark Polar ist aber unser Laufmittel nicht stark polar sollte das Glycin nicht so schnell auf der Chromatographie nach oben bewegen.

Cystein

IEP : 5,0

Unser Laufmittel hat einen pH-Wert von 5. Da der IEP des Cystein bei genau 5.0 ist, liegt das Cystein komplett als Zwitter-Ionen vor.

Im Cystein Molekül liegt ein CH2-SH Rest vor, bei der die Polarität des SH einer OH-Gruppe ähnelt, nur schwächer ist. Also ist Cystein Polar aber nicht stark Polar oder sehr schwach Polar.

Die Polarität dieser Aminosäure ähnelt also sehr des Laufmittels und sollte daher am schnellsten auf der Chromatographieplatte wandern.

Ninhydrin

Ninhydrin ist das Hydrat des Indan 1,2,3-trons und kann für verschiedene Nachweise verwendet werden, wie zum Bleispiel der Nachweis von primären Amino-Gruppen insbesondere Aminosäuren. Es reagiert mit den Aminogruppen von Aminosäuren bei Abspaltung von Wasser zu einer Schiffschen Base. Die Carboxylgruppe der Aminosäure wird decarboxyliert und anschließend der Amino-Rest abgespalten. Es entsteht Amino-Ninhydrin. Zusammen mit Ninhydrin dimerisiert es zu einem violetten Farbstoff welchen man auf der Chromatographiekarte sehen kann.

Reaktion von Ninhydrin

Reaktion auf einem Bild:

Genaue Beschreibung

Als allererstes bindet sich der Stickstoff von der Aminosäure mit einem sogenannten Carbonyl-Kohlenstoff. Gleichzeitig klappt die Doppelbindung zum Sauerstoff auf. Dadruch ist der Sauersoff negativ geladen und der Stickstoff ist positiv geladen. Also wandert ein H-Atom zum dem negativ geladenen Sauerstoff Atom. Anschließend spaltet sich die OH-Gruppe und das H-Atom am Stickstoff ab und bildet Wasser ( H²O ). Dieses Molekül ist die erste Zwischenstufe und wird Ketimin-Derivat genannt.

Als nächstes wird das Ketiminderivat decarboxylisiert. Das Proton des letzten H-Atoms wandert von der bestehenden OH-Gruppe zu dem unteren Sauerstoff-Atom, welches am ursprünglichen Ninhydrin hängt. Da dadurch die OH-Gruppe positiv geladen ist, klappt die Doppelbindung auf und das Elektron bindet sich an die OH-Gruppe welche dadurch wieder neutral wird. Außerdem klappt das Elektron des negativ geladenen Sauerstoffs, durch die Abspaltung des Protons, nach innen, an das C-Atom und spaltet sich vom restlichen Molekül ab. Die Elektronen zwischen dem nun abgespaltenen C-Atom und dem Rest, sowie die Doppelbindung zwischen dem N-Atom und dem Kohlenstoff klappen nach innen in dem Kreis und zu der Doppelbindung zwischen dem N-Atom und dem Rest, damit ein Aldiminderivan entsteht.

Im nächsten Schritt wird das Aldiminderivan in einen Aldehyd und ein Aminoketon durch eine Hydrolyse gespalten. Die Doppelbindung zwischen N-Atom und dem Rest klappt auf und es bildet eine OH-Gruppe daran. Das übrige H-Atom bindet sich an das N-Atom. Dann klappt das Elektron zwischen Rest und dem N-Atom zum N-Atom. Genauso wandert das Elektron des negativen Sauerstoffs zu einer Doppelbindung zum C-Atom und spaltet sich danach ab.

Zuletzt bindet sich ein das Aminoketons mit einem Ninhydrins durch das Bilden an den Carbonylkohlenstoff des Ninhydrins. Zuletzt spaltet sich noch einmal Wasser ab und es entsteht der Farbstoff Ruhemanns-Purpur, welcher man an der blau-violetten Farbe erkennen kann.

Abbildungen von:

Quellen:

ät-Nebenvalenzen-Saccharide