Lab Report

Protokoll Biochemie, Teil B

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Biology

University, School

Karl-Franzens-Universität Graz - KFU

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1, (mehrere), 2013

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Protokoll Teil B

LU Biochemische Übungen

Christopher Ludwig

24. – 25.4.2013


MOL.405, Sommersemester 2013 222220202013


  1. Aufnahme des UV-Spektrums von NAD+ und NADH

    1. Ziel

Ziel des Versuchs war die Aufnahme des UV-Spektrums von NAD+ und NADH sowie die Berechnung des molaren Extinkionskoeffizienten von NADH bei 340nm.

    1. Durchführung

1.2.1) Material:

5*10-5M NAD+ (MW: 663,4 g/mol) in H2O (200ml) wurde anhand folgender Überlegung hergestellt:

5*10-5M NADH (MW: 709,4 g/mol) in H2O (200ml)(Berechnung siehe NAD)

1.2.2) Methoden

Das Beispiel wurde gemäß der Vorschrift „Biochemische Übungen – Praktikum, LU, 8 STD.“ (S.32-52) vom Sommersemester 2013 durchgeführt.


Die Aufnahme der Absorptionsspektren erfolgte zwischen 220 und 400nm im Zweistrahl-Spektralphotometer U-2900 gegen H2O. Die Messung erfolgt in Quarzküvetten.

    1. Resultate

NAD+ wies ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 258,6nm auf. Die Absorptionsmaxima von NADH lagen bei 339,2 und bei 258,6nm


Tabelle B1: Resultate der Absorptionsspektren von NAD+ und NADH


c [mol/l]

ABS260

260[L·mol−1·cm−1]

ABS340

340[L·mol−1·cm−1]

NAD+

5*10-5M

0,685

13700

-

-

NADH

5*10-5M

0,607

12140

0,248

4960

Der molare Extinktionskoeffizient für 340nm wurde durch Umformung des Lambert Beer´schen Gesetzes berechnet:

    1. Diskussion

NAD+ als auch NADH hatten die ihre Absorptionsmaxima nahe den Literaturwerten von 260 bzw. 260 und 340nm. Die Abweichung des molaren Extinktionskoeffizienten vom Literaturwert (6220) kommt möglicherweise durch fehlerhafte Verdünnungen, da die Methode mit dem Auffüllen auf 200ml im Becherglas nicht ganz exakt ist, zustande. Weiters könnten auch Pipettierfehler passiert sein, beziehungsweise könnte auch eine schlechte Durchmischung der Grund für diesen niedrigen Wert sein.

Die Quarzküvetten wurden deshalb verwendet, da Kunststoffküvetten im UV-Bereich das Licht absorbieren würden, was natürlich zu einer Verfälschung der Ergebnisse führen würde.

  1. Bestimmung der ADH-Aktivität bzw. der Ethanol-Konzentration

    1. Ziel

In ausgegebenen Proben sollte mittels optischen Tests die Aktivität der Alkoholdehydrogenase, sowie (in der zweiten Probe) die Konzentration des darin enthaltenen Ethanols bestimmt werden.

    1. Durchführung

2.2.1) Material:

Die Mengen für die Herstellung der Lösungen wurden mit folgender allgemeiner Formel berechnet:

0,15 M Na4P2O7-Puffer: 1,99 g Na4P2O4 in 50 ml H2O

49 mM NAD: 39,4 mg NAD in 1,212 ml H2O

1,5 M Ethanol: 89 µl 96% Ethanol (c=16,8 mol/l V2=

ALDH: 20 mg Lyophilisat in 0,2 ml H2O gelöst.

ADH: zur Verfügung gestellt.

2.2.2) Methoden

Das Beispiel wurde gemäß der Vorschrift „Biochemische Übungen – Praktikum, LU, 8 STD.“ (S.32-52) vom Sommersemester 2013 durchgeführt.

Im Beispiel der Ethanol-Bestimmung wurde die doppelte ALDH-Konzentration verwendet. Diese Bestimmung wurde .....[read full text]

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In jedem Reaktionsansatz dieser Versuche werden pro umgesetzten Molekül Ethanol 2 Moleküle NADH frei (jeweils eines bei der Umsetzung von Ethanol zu Acetaldehyd und bei der Umsetzung von Acetaldehyd zu Acetat). Deshalb muss die Extinktion vor der Aktivitätsberechnung noch halbiert werden.

  1. Bestimmung der GOT-Aktivität

    1. Ziel

Ziel des Versuches war die Bestimmung der GOT-Aktivität einer von der Assistentin ausgegebenen Probe.

    1. Durchführung

3.2.1) Material:

1)0,2M Tris (121,14g/mol): 1,21g + 50ml H2O

2) Aspartat-Lösung: 790,5mg Asp (133,10g/mol) + 10ml 1)

3) α-Ketoglutarat-Lösung: 209,8mg + 5ml 1)

4) Tris 0,1M: 10ml 1) + 10ml H2O

5) Pyridoxal-5-Phosphat-Lösung: Pyridoxalphosphorsäure + 10ml 4)

6) NADH-Lösung: 6,0mg NADH + 1ml 4)

7) Arbeitslösung: 20ml 2) + 10µl MDH + 10µl LDH + 0,5 ml 5) + 0,5 ml 6)

3.2.2) Methoden

Das Beispiel wurde gemäß der Vorschrift „Biochemische Übungen – Praktikum, LU, 8 STD.“ (S.32-52) vom Sommersemester 2013 durchgeführt.

Die Messung wurde 3mal am Spektralphotometer U-2900 durchgeführt. Die Dauer der Messungen betrug jeweils 5 Minuten.

    1. Resultate

Tabelle B3: Extinktionsänderungen der Messungen 1-3


∆E/min

Messung 1

0,048

Messung 2

0,037

Messung 3

0,037

Mittelwert

0,041

Die Berechnungen der Extinktionsabnahme erfolgten durch untenstehende Formel. Aufgrund der Linearität der Umsatzkurve wurde selbige als gesamtes für die Auswertung herangezogen.


Tabelle B4: Erge.....

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4.2.2) Methoden

Die Durchführung dieses Versuchs erfolgte laut Skript „Vorschrift „Biochemische Übungen – Praktikum, LU, 8 STD.“ (S.32-52)

Die Messungen wurden bei 405nm durchgeführt. Zur Verbesserung der Präzision wurde eine Dreifach-Bestimmung gemacht.

4.3) Resultate

Tabelle B5: Ergebnisse von ∆E/min und v bei verschiedenen Substratkonzentrationen


Substrat [ml]

∆E/min bei 405nm

v [mol/min]

Küvette 1

0,2

0,025

2,5*10-6

Küvette 2

0,4

0,046

4,6*10-6

Küvette 3

0,8

0,081

8,1*10-6

Küvette 4

1,6

0,124

1,3*10-5

Die Berechnungen der Extinktion/min und der Geschwindigkeit wurden anhand folgender Formeln durchgeführt:


wobei Ɛ405=9900


Diagramm B1: Zeit-Umsatzkurve für Küvetten 1-4 während der Bestimmung von v bei verschiedenen Substratkonzentrationen für die Erstellung eines Lineweaver-Burk-Plots. Die Substratkonzentration nimmt von Küvette 1 nach Küvette 4 zu.


Tabelle B6: Berechnungen für Lineweaver-Burk-Plot

Substrat [ml]

v [mol/min]

c Substrat [mol/l]

1/[S]

1/v


0,2

2,53E-06

7,67E-05

1,30E+04

3,96E+05


0,4

4,65E-06

1,53E-04

6,52E+03

2,15E+05


0,8

8,18E-06

3,07E-04

3,26E+03

1,22E+05


1,6

1,29E-05

6,13E-04

1,63E+03

7,73E+04


Diagramm B2: Lineweaver-Burk-Plot für Küvette 1-4


Die Berechnung von Ks und vmax erfolgte durch Bestimmung der Schnittpunkte mit der Abszisse bzw. der Ordinate.

KS=8,5*10-4mol/l vmax=3,1*10-5mol/min


Die Berechnung der von willkürlichen Substratkonzentrationen erfolgte durch die Michaelis-Menten-Gleichung (siehe unten). Die graphische Darstellung ist in Diagramm B3 zu sehen, welche ebenfalls ein vmax von etwa 3*10-5 ergibt.



Diagramm B3: Michaelis-Menten-Hyperbel, erstellt durch Einsetzen mehrerer willkürlicher Werte in die Michaelis-Menten-Gleichung unter Verwendung der zuvor ermittelten vmax und KS.

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Ein weiterer Grund für Abweichungen könnte sein, dass die Substratzugabe in den Küvetten zeitlich versetzt stattfand, und so die Umsetzung zu unterschiedlichen Zeitpunkten startete.

Zur Berechnung von ∆E/min konnten aufgrund der guten Linearität alle Messwerte zwischen Minute 0 und Minute 10 herangezogen werden.

5.) Inhibitorkinetik

5.1) Ziel

Mithilfe zweier unterschiedlicher Methoden (Lineweaver-Burk-Plot und graphisch nach Dixon) sollte KI eines kompetitiven Inhibitors ermittelt werden.

5.2) Durchführung

5.2.1) Material

Die Lösungen von Kapitel 4 wurden weiterverwendet, zusätzlich wurde eine 0,30 mM Inhibitor-Lösung hergestellt:

23,5 mg Benzamidinhydrochlorid (MW=156,61 g/mol) in 500 ml H2O

5.2.2) Methoden

Die Durchführung dieses Versuchs erfolgte laut Skript „Vorschrift „Biochemische Übungen – Praktikum, LU, 8 STD.“ (S.32-52) vom Sommersemester 2013. Aufgrund mangelnden Puffers wurde bei der Bestimmung von KI nach Dixon nur eine Zweifachbestimmung durchgeführt.

5.3) Resultate

In der Bestimmung von KI mittels Lineweaver-Burk-Plot wurden die Substratkonzentrationen in den Küvetten variiert und die Änderung der Extinktion über 10 Minuten verfolgt.

In jeden Ansatz wurden unterschiedliche Volumina an 1,15 mM N-α-Benzoyl-L-arginin-4-nitroanilid pipettiert. Die tatsächlich in der Küvette vermessene Konzentration wurde anhand fo.....

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Diagramm B5: 1/v, aufgetragen gegen 1/[S] im Lineweaver-Burk-Plot von Kapitel 4 (blau).


Der errechnete x-Wert von -489,49 wurde, genauso wie der in Kapitel 4 errechnete Km-Wert (8,5*10-4 mol/l) und die Inhibitorkonzentration von 0,00002 mol/l in folgende Formel eingesetzt:

Durch Umformen wurde für KI ein Wert von 1,43*10-5 bzw. 14,3 µmol/l errechnet.


Zur graphischen Ermittlung von KI nach Dixon wurde die Inhibitorkonzentration in den 4 Ansätzen verändert. Die Konzentration des in der Küvette vermessenen Inhibitors wurde wie oben anhand der pipettierten Menge an 0,30 mM Inhibitor-Lösung in den 3 –ml-Ansatz berechnet.


Tabelle B8: Werte für die Bestimmung von KI durch die optische Methode nach Dixon.

Küvette

pipettiertes V(Inhibitor)

[I] in mmol/l

Durchschnitt ΔE405/min

v [mmol/min]

1

0,05 ml

0,005

0,023

0,00232323

2

0,1 ml

0,01

0,0201

0,00203030

3

0,2 ml

0,02

0,0162

0,00163636

4

0,4 ml

0,04

0,01195

0,00120707

1/v wurde in einem Diagramm gegen die Inhibitorkonzentration in mol/l aufgetragen, wobei die entstehende Gerade mit folgender Gleichung beschrieben werden kann:

y=1*1010x+378278

Wird diese Gerade mit der Gerade y = 1/vmax, also y = 32.603 geschnitten, erhält man für –KI einen Wert von -3,4*10-5 mol/l, und somit für KI 34 µmol/l.


Diagramm B6: Auftragung von 1/v gegen die Inhibitorkonzentration zur Ermittlung von KI n.....

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Wenn die Ergebnisse für die beiden Bestimmungsmethoden erfahrungsgemäß nicht so weit auseinander liegen, muss man davon ausgehen, dass ein systematischer .....

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