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Zusammenfassung

Grundlag­en der Molekula­rbiologi­e: Transpos­ition und Proteine

5.681 Wörter / ~18 Seiten sternsternsternsternstern_0.25 Autor Gregor M. im Nov. 2010
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Zusammenfassung
Biowissenschaften

Universität, Schule

Karl-Franzens-Universität Graz - KFU

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Gregor M. ©
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sternsternsternsternstern_0.25
ID# 2960







Molekularbiologie



Transposition

Bei DNA-only Transposons wird zwischen der konservativen Transposition und der replikativen Transposition unterschieden. Während bei der konservativen Transposition das Transposon aus der DNA herausgeschnitten und an anderer Stelle wieder eingebaut wird ("cut & paste"), wird bei der replikativen Transposition das Transposon nicht herausgeschnitten, sondern eine Kopie erstellt, die an anderer Stelle eingebaut wird ("copy & paste").

Bei der replikativen Transposition wird die Anzahl der Transposons vermehrt. Das Herausschneiden bzw. das Kopieren des Transposons erfolgt mit Hilfe des Enzyms Transposase. Transposons haben unterschiedliche Strukturen. Sie enthalten aber meistens an beiden Enden kurze Sequenzwiederholungen, die als Bindestellen für die Transposase dienen.

IS-Elemente (Insertionssequenzen) gehören zu den DNA-only Transposons. Sie tragen ausschließlich die Sequenzen die für die Transposition notwendig sind und die Gene für die Transposasen, Enzyme, die den Vorgang katalysieren. Sie springen mit relativ niedriger Frequenz und sind ca. 700 bis 1000 bp lang. Die DNA wird an zwei Stellen so geschnitten, dass an einem Strang ein 3‛- am anderen Strang ein 5‛-Überhang generiert wird.

Dann wird das IS-Element eingefügt und die Überhänge repliziert. Würde das IS-Element erneut springen würden diese replizierten flankierenden Regionen auf der DNA zurückbleiben. Spring ein IS-Element in ein Gen, kann die Zelle also auch sterben, wenn das Gen essentiell war. Anwendung in der Praxis: Transposonmutagenese.

Bei Retroviral-like Retrotransposons wird die einzelsträngige RNA in DNA umgeschrieben. Dabei generiert die reverse Transkriptase zuerst einen komplementären DNA Strang zum RNA-Molekül und zuletzt eine doppelsträngige DNA. Diese greift, nachdem sie an zwei Stellen von der Integrase geschnitten wurde, mit Hilfe der beiden freien 3‛-OH-Gruppen die Ziel-DNA an und wird eingebaut.

Zuletzt werden die flankierenden Enden des viralen DNA-Moleküls repliziert.

Non-retrovirale Retrotransposons haben eine reverse Transkriptase aber ansonsten keine Ähnlichkeit mit Retroviren. Das Line-Element (L1-Element) wird nicht aus der DNA herausgeschnitten sondern es wird über die reverse Transkriptase eine RNA synthetisiert. Weiters werden A-Reste ans 3‛-Ende gehängt. Dann wird die Ziel-DNA an einem Strang geschnitten, so dass ein freies 3‛-Ende entsteht und die RNA wird in DNA umgeschrieben.

Die freien Enden paaren sich und der DNA Strang wird ins Zielmolekül eingebaut. Nach weiteren Schritten wird ein zweiter DNA Strang generiert. Schlussendlich wurde eine Kopie von L1 ins Genom integriert.

Einteilung von Proteinen

1.       Helix-turn-Helix (DNA-bindendes Motiv)
Ist entscheidend für die Wechselwirkung vieler prokaryotischer regulatorischer Proteine mit der DNA. Das Motiv besteht aus 2 α-Helices, die durch einen β-Loop verbunden sind. Da die Struktur an sich nicht stabil ist, ist sie meist Teil eines größeren Proteins.

Eine der beiden Helices stellt die „Erkennungshelix“ dar, deren AMS sequenzspezifisch in die große Furche der DNA binden, z.B. Cro, LacI, TrpR in Prokaryonten, Oct1/2 in Eukaryonten. Die Erkennungssequenz ist oft ein Palindrom, weshalb das Protein dann immer als Dimer binden muss.

2.       Homöodomäne (gefunden in den homöotischen Genen) àProteine mit dieser DNA-bindenden Domäne wirken insbesondere während der Entwicklung von Eukaryonten als Transkriptionsregulatoren. Besteht in der Regel aus 3 Helices, die in einem anderen Winkel stehen als bei Helix-Turn-Helix-Motiven. Das Protein bindet als Heterodimer aber nicht an eine Palindromsequenz.

3.       Zink koordinierende Proteine
Recht heterogene Gruppe. Allen gemeinsam ist, dass sie Zn2+ gebunden haben. Die Bindung der einzelnen Zinkfinger an die DNA ist sehr schwach. Die meisten Proteine besitzen daher mehrere Zinkfinger, die gleichzeitig an die DNA binden und so die Wechselwirkung wesentlich stärker ist.

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Bei einem Zinkfinger bilden mehrere AMS eine verlängerte Schleife, die an der Basis von einem einzelnen Zn2+-Ion zusammengehalten werden.
Das Ion wird selbst von 4 AMS (2 Cys und 2 His, z.B. Sp1, Hormonrezeptoren oder 4 Cys, z.B. Gal4 (Pilze), Steroid, Thyroid) koordiniert und tritt nicht mit der DNA in Wechselwirkung, sondern wirkt stabilisierend. 1 Zinkfinger kann 3 NTP binden.

Umso mehr Zinkfinger das Protein besitzt umso spezifischer ist die DNA Sequenz, die es bindet.

4.       Zipper hältige Proteine

a.       Viele DNA-bindende Proteine (Transkriptionsfaktoren) binden als Dimere an die DNA. Der Leucin Zipper ist eine Strukturdomäne, die die Bildung von Dimeren möglich macht. An jeder 7. Stelle des Proteins liegt ein Leucin. Durch die hydrophoben AMS kommt es zur Bildung eines Dimers, z.B. Jun und Fos bilden AP1.

b.      Helix-Loop—Helix
Kommt in Regulatorproteinen vor, die während der Entwicklung vielzelliger Organismen an der Steuerung der Genexpression mitwirken. Helix-Loop-Helix-Motive zweier Polypeptide treten in Wechselwirkung miteinander, sodass sich ein Dimer bildet und binden die DNA in der großen Furche.

Für die DNA Bindung sorgt eine kurze, benachbarte AMS-Sequenz mit vielen basischen AMS, die der getrennten DNA-bindenden Region in Proteinen mit Leucin-Zipper ähnelt, z.B. MyoD

5.       β-Faltblatt Proteine
Der einzige Vertreter dieser Gruppe ist das TATA-box-binding Protein (TBP)
Seine Besonderheit ist, dass es in der kleinen Furche der DNA bindet, aufgrund von Phenylalanin Resten, die in die DNA interkalieren und so zu einem Knick in der DNA führen.

Man kann DNA-Protein-Wechselwirkungen untersuchen. Eine Methode wäre EMSA (electrophoretic mobility shift assay). Zuerst wird ein DNA-Fragment mit Sequenzen, die vermutlich von einem DNA-bindenden Protein erkannt werden, isoliert und radioaktiv markiert. Dann werden die DNA-Fragmente mit Hilfe vom Enzym DNase I gespalten, wobei jedes Molekül im Durchschnitt 1 Bruch enthält.

In einem zweiten Ansatz werden die DNA-Fragmente zuerst von dem DNA-bindenden Molekül gebunden und dann mit DNase I behandelt. Das Enzym kann an Stellen, wo das Protein gebunden hat die DNA nicht spalten. Anschließend werden die Stränge nebeneinander in nicht denaturierenden Polyacrylamid Gel aufgetrennt. Dort wo das Protein gebunden hat, kann man eine Lücke entdecken und so diese DNA-Fragmente mittels DNA-Sequenzierung identifizieren, um die genaue Bindestelle des Proteins ausfindig zu machen.

PCR - Polymerase Chain Reaktion
Wenn man zumindest die flankierenden Bereiche eines zu klonierenden DNA-Abschnitts kennt, kann man die Kopienzahl dieses Abschnittes mithilfe der Polymersekettenreaktion vermehren. Zuerst stellt man 2 synthetische Oligonukleotide her, die zu den flankierenden Sequenzen auf der gewünschten DNA komplementär sind, damit der gesamte DNA-Abschnitt repliziert wird.

Meistens wird eine hitzestabile Polymerase verwendet, da diese beim Erhitzen stabil bleibt und nicht erneut hinzugegeben werden muss.

Eukaryontische Replikation

Die eukaryontische Replikation ist über den Zellzyklus reguliert. Die Regulation stellt sicher, dass die gesamte zelluläre DNA nur einmal pro Zellzyklus repliziert wird.

Hefe besitzt festgelegte Replikationsursprünge, die als autonom replizierende Sequenzen (ARS) oder Replikatoren bezeichnet werden. Es gibt ungefähr 551 ARS auf den 16 Chromosomen der Hefe. Bei Wirbeltieren sind die Replikationsursprünge eine Reihe von A=T-reichen Sequenzen. Allgemein sind die Replikationsursprünge bei Eukaryonten jedoch kürzer als bei Prokaryonten und es gibt nicht nur einen sondern viele, die über das ganze Genom verteilt sind.

Weiters beginnt die Replikation oft an mehreren Replikationsursprüngen gleichzeitig, da die Replikation langsamer verläuft, dafür läuft sie dann in beide Richtungen. Deswegen werden die eukaryontischen Replikons auch als OBR (Origin of bidirectional replication) bezeichnet.

Viren:

SV40

5 500 bp

Lambda

48 600 bp

Vaccinia

190 000 bp

Bakterien:

Mycoplasma

760 000 bp

E. coli

4 600 000 bp

Eukaryonten:

Hefe

13 500 000 bp

Mensch

3 200 000 000 bp


Wie die Bakterien besitzen auch die Eukaryonten mehrere DNA Polymerasen:

DNA Polymerase α

-

Primer Synthese

DNA Polymerase δ

3‛-5‛Exonucleaseaktivität

DNA Synthese

DNA Polymerase ε

3‛-5’Exonucleaseaktivität

Reparatur, DNA Synthese

DNA Polymerase γ

3‛-5‛ Exonucleaseaktivität

mitochondrielle Polymerase

PCNA (proliferating cell nuclear antigen)

Assoziiert mit DNA-Pol. δ.
In sich teilenden Zellen in hoher Konzentration vorhanden.

Processivität (bildet ringförmige Klammer; RFC ist der clamp-loader (ATP abhängig) und gehört zu den Triple A-Proteinen

Replication factor A

Single-strand-binding Protein

Topoisomerase I & II

Supercoils

MF1 (5‛-3‛ exonuclease)

Remove RNA

DNA Ligase I

Auffüllen von Nicks

AP-1 (Aktivator Protein 1)

Transkriptionsfaktor, heterodimeres Protein, das aus Proteinen der c-Fos und c-Jun Familie aufgebaut ist. Reguliert Genexpression, Differenzierung, Proliferation, Apoptosis;

Eukaryontischer Zellzyklus

Die zeitliche Abfolge des Zellzyklus wird über bestimmte Proteinkinasen gesteuert, deren Aktivität sich aufgrund zellulärer Signale ändert. Proteinkinasen phosphorylieren bestimmte Proteine. Die Kinasen sind Heterodimere aus einer regulatorischen Untereinheit, dem Cyclin, und einer katalytischen Untereinheit, der cyclinabhängige Proteinkinase (CDK).Ohne Cyclin ist die katalytische Untereinheit praktisch inaktiv.

Erst wenn Cyclin an die CDK bindet, kommt es zu einer Strukturänderung, die die Aktivität der CDK extrem steigert. Die Cycline werden am Ende der M-Phase schnell über ubiquitinvermittelte Proteolyse abgebaut.

Der Replikationsursprung wird über die Bindung des origin recognition complex (ORC) festgelegt. Die Struktur des ORC ist hochkonserviert. Für die Bindung an die DNA muss ORC ATP binden. Am Ende der Mitose werden zwei Proteine Cdc6 und Cdt1 zum ORC rekrutiert. Cdc6 und einige Untereinheiten des ORC gehören zu den AAA+- ATPasen.

Die beiden Proteine sind für die Beladung der DNA mit dem MCM2-7-complex (minichromosome maintenance), bestehend aus 6 Proteinen, notwendig.
Den entstandenen Komplex aus MCM2-7, Cdt1, Cdc6 und ORC bezeichnet man als präreplikativen Komplex (prä-RCs), durch dessen Bildung die Zelle bereit für die Replikation ist; ein Zustand, der auch häufig als Lizensierung bezeichnet wird.

Nach der G1-Phase treten viele Zellen in die Stationäre Phase ein. Dabei können prä-RCs, die am Ende der M-Phase gebildet wurden, verloren gehen. Der prä-RC wird zum prä-Initiationskomplex durch die Rekrutierung von Faktoren, wie Cdc45 und Sld3. Cdc45 spielt sowohl während der Initiation als auch während der Elongation eine Rolle.

Den Übergang von der S-Phase in die G1-Phase steuern zwei konservierte S-Phase-Cyclin-CDK-Komplexe, der Cyclin-E-CDK2-Komplex und CDC7-DBF4. Werden diese Kinasen aktiviert, unterstützen sie die Aktivierung der Replikation durch die Bindung an etliche Proteine des prä-RC und deren Phosphorylierung. Die Origins werden durch MCM2-7 entwunden und ssbProtein RPA wird an die

DNA rekrutiert. Nach dem Entwinden der DNA am Origin, wird die erste DNA-Polymerase rekrutiert. Dabei handelt es sich um DNA-Polymerase α, eine Primase, die den RNA-Primer synthetisiert (ca. 6-7 NTP). Es folgt die bidirektionale DNA-Replikation, wahrscheinlich mit DNA-Polymerase δ.

Supercoils werden mit Hilfe der Topoisomerasen I und II aufgelöst. Topoisomerase II kann aber auch Catenane auflösen. DNA-Schäden führen zur Inhibition der Initiation durch ATM und ATR (Kinasen). Dadurch gewinnt die Zelle Zeit für die DNA-Reparatur. Der Eintritt in die Mitose ist blockiert.

Zum Abbau der Primer auf dem Folgestrang wird die flap-Endonuklease Fen1 und die Helikase/Endonuclease Dna2 benötigt, gefolgt von Ligase I.

Nach der Replikation verbleiben die zwei Tochtermoleküle eng assoziiert, was als Sister Chromatin Cohesion bezeichnet wird und nur während der Replikation passieren kann. Weiters kann eine Post-Replikations-Reparatur stattfinden, die z.B. falschgepaarte Basen ausbessert.


TELOMERE

Ein anderes Problem bei der Replikation linearer DNA ist, dass die Replikation nur in 5‛-3‛-Richtung abläuft. Daher wird der Leitstrang synthetisiert bis die Polymerase runterfällt, am Folgestrang würde man jedoch am 3‛-Ende einen Primer benötigen. Der Primer besteht jedoch aus RNA und kann daher nicht repliziert werden.

·         Mensch: TTAGGG

·         Pflanzen: TTTAGGG

·         Tetrahymena: TTGGGG

Das Enzym Telomerase (TERT) ist für die Aufrechterhaltung der Telomere in sich teilenden Zellen verantwortlich. Die Telomerase ist eine reverse Transkriptase und kann DNA aufgrund ihres mitgebrachten RNA-Stranges synthetisieren. In humanen Zellen generiert die Telomerase einen 100 bis 200 nt langen einzelsträngigen 3‛ Überhang, indem sie den Template an den letzten repeat bindet und dann einen neuen repeat hinzufügt.

Dabei entsteht ein 3‛-Überhang. Dieser ist nicht unproblematisch, da er mit anderen Chromosomen rekombinieren kann. Daher wird die DNA zu einem Loop gefalten und der Überhang wird in die DNA eingebaut, indem er den 2. Strang an dieser Stelle verdrängt. TRF1 und TRF2 regulieren die Aktivität von TERT, damit sie nicht unendlich lang weiterrepliziert.

Hohe Tert Aktivität in Stammzellen und Krebszellen, wobei manche Krebszellen alternative Methoden haben um Telomere zu verlängern. Tert befindet sich normalerweise nicht im somatischen Gewebe, Ausnahme sind die peripheren Lymphozyten, epitheliale Gewebe, z.B. die Darmschleimhaut, Epidermis (Basalzellen). Weiters ist die Telomerasefunktion auf die S-Phase beschränkt.

Auf diese Weise wird der Chromatin-Status weitergegeben. Dafür ist die postreplikative Assemblierung der Nukleosomen notwendig. Derzeit glaubt man, dass Histon-Chaperone die Histone zur DNA geleiten.

Der Großteil der Chromatinassemblierung findet während der DNA-Replikation in der S-Phase des Zellzyklus statt. Die replikationsabhängige Chromatinassemblierung wird durch das Histon-Chaperon CAF-1 (chromatin assembly factor-1) vermittelt. Humanes CAF-1 bindet die Histone H3 und H4. Die mit CAF-1 interagierenden Histone unterscheiden sich vom Großteil der zellulären Histone durch ihre posttranslationellen Modifikationen.

Nach der Synthese werden beide Histone acetyliert und Histon H4 weist ein spezifisches Profil von Di-Acetylierungen an den Lysin-Resten 5 und 12 auf, die zwischen unterschiedlichen Spezies konserviert sind.
Im Anschluss an die Aufnahme von acetyliertem Histon H3 und H4 in die DNA werden die Acetylierungsmuster beider Histone durch nukleäre Histon-Deacetylasen entfernt.

Die replikationsabhängige Nukleosomenassemblierung erfolgt in zwei aufeinanderfolgenden Schritten. Der erste Schritt ist die CAF-1 vermittelt Ablage von Histon H3-H4 Tetramer auf die sich replizierende DNA. In einem zweiten Schritt, der unabhängig von der DNA Replikation ist, werden zwei Histon H2A-H2B Dimere am H3-H4 Tetramer abgesetzt, wodurch ein vollständiger Nukleosomen Kern ausgebildet wird.

Untereinheit. Darüber hinaus interagiert der N-terminale Teil von p150 mit der DNA-Polymerase Klammer PCNA.

Zur Termination kommt es wenn zwei Polymerasen aufeinandertreffen und die DNA dazwischen ligiert wird. In Eukaryonten weiß man nur sehr wenig darüber. Nach der Assemblierung der Mitosespindel werden die Schwesterchromatiden in die entgegengesetzten Pole gezogen. Erst wenn die Trennung komplett abgelaufen ist, werden die CDKs abgebaut.

Transkription

PROMOTOR ERKENNUNG

·         σ70 (House-keeping-genes)

·         σ32 (Hitzeschock)
Unter normalen Bedingungen wird dieser Faktor auf Grund seiner geringen Halbwertszeit (30sec) zu schnell abgebaut. Ein Chaperon (DnaK) bindet den Faktor und bringt ihn zu einer Protease (FDSH). Weiters wird die Transkription durch Sekundärstrukturen erschwert, die zum Ablesen aufgebrochen werden müssen.
Bei Hitze werden Proteine transkribiert, die σ32 abhängige Promotoren besitzen, z.B. Chaperone.

Daher wird 1. mehr vom Faktor produziert, weil die Sekundärstrukturen bei Hitze aufgehen und daher die Transkription leichter von sich geht;
und 2. sind die Chaperone anderswertig beschäftigt (denaturierte Proteine), so dass sie nicht so effektiv σ32 binden können und die Halbwertszeit auf 5min erhöht wird.

Dieser Aktivator hilft dabei, die DNA aufzuschmelzen. Bindet das Enzym und der σ-Faktor bildet sich der sogenannte geschlossene Komplex. Dieser ist normalerweise sehr kurzlebig. Bei σ54 nicht!! Durch einen loop kommt es zum direkten Kontakt zwischen Enhancer und geschlossenen Komplex.

·         σE (Hitzeschock)
Dieser σ-Faktor ist an das membrangebundene Protein RseA gebunden. RseA ist eigentlich ein Anti-Sigma-Faktor, weil er den Kontakt zwischen σ-Faktor und Enzym verhindert. Bei Zellstress denaturieren outer membran proteins (Obs) und aktivieren die DegS-Protease.

Diese spaltet RseA an der periplasmatischen Seite und YaeL spaltet RseA im cytoplasmatischen Raum. Daraufhin wird σE freigesetzt und kann an das Core-Enzym binden.

INITIATION
Das Core-Enzyms hat irgendwo an die DNA gebunden. Sobald der σ-Faktor gebunden hat, diffundiert das Holoenzym von der unspezifisch gebundenen DNA, „sucht“ den Promotor und bindet schließlich an ihn.
Der σ-Faktor kann ohne das Enzym nicht an den Promotor binden. Es gibt Gene, die mehrere Promotoren besitzen.
Der Promotor ist eine DNA-Sequenz, die sich von -70 (vor dem Beginn der RNA) bis +30 (nach dem Beginn der RNA) erstreckt.

Die 2.4-Region erkennt die -10-Region.

Das Enzym hat als geschlossener Komplex an die intakte DNA gebunden. Erst wenn der geschlossene Komplex in den offenen übergeht, beginnt das Aufschmelzen der DNA.

Die 3.2 Region wird als Loop ins aktive Zentrum der RNA-Pol. exprimiert. Das ist auch der Grund, warum die RNA-Polymerase keinen Primer benötigt: Der Loop richtet das 1. NTP richtig aus! Meist ist das 1. NTP ein Purin (A oder T).
Die 3‛-OH-Gruppe des Purins macht einen nukleophilen Angriff auf das α-Phosphat des 2.NTP. Es wird eine Phosphodiesterbindung geknüpft und ein Pyrophosphat abgespalten.

Im aktiven Zentrum des Enzyms sitzt Mg2+ und das Enzym ist langsamer als die DNA-Polymerase (nur 45 NTP pro Sekunde). Es folgt die „Abortive Initiation“ - der „Ternary-Komplex“ beginnt damit die RNA zu synthetisieren, bricht ab, beginnt wieder, usw. Das liegt wahrscheinlich daran, dass durch den Loop kein Platz für die Elongation ist.

ELONGATION
Nach Beginn des Aufschmelzens kommt es zu strukturellen Änderungen. Zuerst wird der Loop (3.2 Region) verdrängt, danach die 4.2 Region, da sie den Ausgang der RNA versperrt, die unter dem β-flap hindurch aus dem Enzym transportiert wird. Daraufhin muss der σ-Faktor ab diffundieren, weil er nicht mehr stabil genug gebunden ist.

TERMINATION
Es gibt zwei Arten der Termination

1.       intrinsische Termination oder rho-unabhängige Termination

Durch die Ausbildung einer Hairpinstruktur kommt es zur Termination. Dieser Hairpin bildet sich aus, wenn auf der DNA ein GC-reicher invertet repeat auftaucht, dem mind. 6-7 Uracil-Reste nachfolgen. Der loop des Hairpins ist rel. klein. Durch diesen U-Stretch kommt es zum Pausieren des Enzyms. NusA (=Transkriptionsfaktor und Terminationsfaktor) verlängert die Pause und bindet an die schwache RNA-Bindestelle im Enzym.

NusA erhöht nur die Effizienz, ist aber nicht unbedingt notwendig. Die RNA ist normalerweise im Enzym an eine schwache Bindestelle (UBS) und an eine starke Bindestelle (RBS) gebunden. Ist NusA an UBS gebunden, kann die RNA nicht mehr binden und die Ausbildung der Hairpinstruktur ist vereinfacht. Gleichzeitig wird die Heteroduplex im U-Stretch aufgespalten und es kommt zu einer Konformationsänderung des Enzyms.

Der σ-Faktor und NusA können nicht gleichzeitig an die Pol binden. Daher bindet NusA sobald der σ-Faktor ab diffundiert ist und bleibt bis zur Ter-Sequenz gebunden.

Der ρ-Faktor ist eine ATPase und terminiert rund 60% aller Transkriptionen in E.coli. Bei ρ handelt es sich um ein hexameres Protein mit 2 DNA-bindenden-Domänen. Eine am N-terminalen Ende, die zweite im Inneren des Proteins. Rho erkennt die rut-site (rho-utilisation-site mit einem hohen C-Anteil) und bindet über das N-terminale Ende daran.
Erst nach der Bindung von rho an die rut-site kommt es zur Ausbildung des Hexamers.

Rho bewegt sich an der DNA entlang und zieht die RNA aus der Polymerase durch die mittlere Öffnung, muss jedoch für die Termination die Polymerase einholen. Das geht nur wenn die Polymerase langsamer wird und wenn keine Ribosomen an der RNA sind, am Stopcodon fallen die Ribosomen von der mRNA.

Antitermination
Überlesen einer Terminatorsequenz, wenn ein Antiterminationsfaktor bindet. Dieser erkennt auch Sekundärstrukturen auf der mRNA.

Die Expression wird über mehrere Wege reguliert:

1.       Negative Kontrolle
„Gen wird transkribiert und extra abgeschalten“

2.       Positive Kontrolle

Das lac Operon wird mittels CAP positiv reguliert

Das lac Operon codiert für 3 Strukturgene:

1.       lacZ – β-Galactosidase Gene – spaltet Laktose

2.       lacY – Permease – Membranprotein, für den Transport der Laktose in die Zelle zuständig

3.       lacA – Transacetylase – Funktion unbekannt

Es gibt einen Promotor, 3 Operatoren (-82, +11, +420) und einen Terminator

Weiters liegt vor dem eigentlichen lac Operon das lacI Gen. Dieses Gen besitzt einen eigenen Promotor und einen eigenen Terminator. Das lacI Gen codiert für den negativen Repressor des lac Operons. Der Repressor wird zwar konstitutiv transkribiert und translatiert, jedoch mit sehr schlechter Effizienz. Der Repressor bindet nach seiner Expression sofort an 2 Operatoren.

Die RNA-Polymerase kann zwar binden, kann aber die Transkription nicht initiieren.

Laktose gelangt über die Permease in die Zelle und wird dann durch die β-Galactosidase abgebaut. Eine Nebenreaktion der β-Galactosidase führt zur Bildung von Allolaktose. Wenn Allolaktose an den Repressor bindet, kommt es zu einer Strukturänderung (allosterische Inhibition). Die mittlere Domäne rotiert um 10°. Da die C-terminale Domäne mit einem zweiten Dimer verbunden ist, geht die hinge-Region und Helix-Turn-Helix-bindende Domäne auseinander (wie Schere).

Quellen & Links

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