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Protokoll
Biowissenschaften

Karl-Franzens-Universität Graz - KFU

2,-,2016

Annemarie K. ©
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sternsternsternsternstern
ID# 81166







Mikrobiologische Ãœbungen

SS2016


Versuch E1-Eigene Proben (Wasserprobe)

Ziel

In diesem Versuch sollen mitgebrachte Proben in diesem Fall die eines Teichwassers kultiviert und Bakterien nachgewiesen bzw. näher bestimmt werden um zu zeigen das sich überall in der Umwelt Mikroorganismen befinden, obwohl wir sie mit freiem Auge nicht erkennen können.

Durchführung

Zuerst wurden 100µl des Teichwassers auf einer CASO-Platte ausplattiert und einen Tag lang bei 37°C bebrütet (Skript S10). Danach wurden 10ml des Teichwassers durch einen Sterilfilter (Porendurchmesser 0,45µm) filtriert. Allerdings war der Sterilfilter nicht sachgemäß verschlossen, deshalb musste man den Filter nach 7ml tauschen.

Der Filter nach 7ml und der Filter nach (den restlichen) 7ml wurde auf eine MacConkey-Agar gelegt wobei der 3ml Filter umgedreht liegt. Zum Schluss wurde das Filtrat noch auf eine CASO-Platte ausplattiert. Beide Platten wurden bei 37°C über Nacht bebrütet.

Nach der Bebrütung wurden 3 erkennbare Kolonien von der CASO-Agarplatte des ausplattierten Teichwassers entnommen und auf CASO-Agar als Verdünnungsausstrich ausgestrichen und einen Tag lang bei 37°C bebrütet. Danach wurden von diesen jeweils noch ein Verdünnungsausstrich auf MacConkey-Agar und Blutagar ausgestrichen und jeweils einen Tag lang bei 37°C bebrütet.

Von den Bakterien x2 und x3 wurde jeweils noch eine Gramfärbung durchgeführt. (Skript S. 20)

Ergebnisse

Auf der MacConkey-Platte mit den filtern sind mindestens 2 verschiede Koloniearten auszumachen. In Form und Größe sind sie sich ähnlich (wellige, ca. 2,3mm große Bakterien, deren Ränder teilweise verlaufen) allerdings verfärbt sich einer rot und der andere weiß. (Abb.2)

Das Filtrat der Wasserprobe weist einen ähnlichen Bewuchs wie die ausplattierte Wasserprobe auf, allerdings ist sie weniger bewachsen (Abb. 3).

Abb. 3: ausplattiertes Filtrat

Abb. 2: Filter (rechts 7ml und links 3ml)

Abb.1: Ausplattierte Wasserprobe


Auf der CASO-Platte des ausplattierten Teichwassers ist dichter Belag gewachsen wobei man mindestens 3 verschiedene Koloniearten ausmachen kann (Abb. 1). Tabelle (Tab. 1) beschreibt das Aussehen der Bakterien.

Tab 1: Aussehen der Bakterien


Bakterien

Größe (∅ in mm)

Farbe

Kolonienform

x1

5,5mm

in der Mitte klar/durchsichtig und am Rand weißlich

Rand: konzentrische Zonen

Profil: erhaben

x2

3mm

gelblich

Rand: wellig/glatt

Profil: erhaben/flach

x3

1,5mm

cremefarben/gelblich

Rand: glatt

Profil: konvex/flach

Das Bakterium x1 (Abb. 4) wächst nicht auf MacConkey (Abb. 8) und bildet auf Blutagar keinen Hemmhof (Abb. 9)

Das Bakterium x2 (Abb. 5) wächst weiß auf MacConkey (Abb. 7) und bilden auf Blutagar (Abb. 9) einen grünen Hemmhof.

Bakterium x3 (Abb. 6) wächst weiß auf MacConkey (Abb. 8) und bilden auf Blutagar (Abb. 9) einen grünen Hemmhof.


Abb.8: Verdünnungsausstrich x1 (rechts) und x3 (links) (MacConkey-Agar)

Abb. 6: Verdünnungsausstrich x3 (CASO-Agar)

Abb. 5: Verdünnungsausstrich x2 (CASO-Agar)

Abb. 4: Verdünnungsausstrich x1 (CASO-Agar)


Abb. 9: Verdünnungsausstrich x1 (links), x2 (rechts) und x3 (oben) (Blutagar)

Abb. 7: Verdünnungsausstrich x2 (MacConkey-Agar)


Das Bakterium x2 (Abb. 10 / Zeichnung 1) wird in der Gram-färbung als rosa (Gram-negatives) Stäbchen sichtbar, sie Stäbchen hängen manchmal als Kette zusammen. Hin und wieder sieht man blau/lila stellen im Bild, diese sind wahrscheinlich Verunreinigungen oder das Kristallviolett wurde nicht richtig abgespült.

Das Bakterium x3 (Abb. 11 / Zeichnung 2) wird durch die Gram-Färbung als rosa (Gramnegativ) Stäbchen sichtbar, die Stäbchen hängen häufig als Kette zusammen.


Abb. 10: Gram-Färbung von x2

Abb. 11: Gram-Färbung von x3


Diskussion

Das Bakterium auf den Filter welches sich rot verfärbt ist in der Lage Laktose zu verwerten während das weiß/cremfarbe Bakterium nicht dazu in der Lage ist. (Abb. 2)

Bei dem ausplattierten Filtrat (Abb. 3) sollte eigentlich nicht bewachsen sein leider ist das hier nicht der Fall, da beim Filtrieren Fehler gemacht worden sind.

Das Bakterium x2 (Abb. 5) ist es ein negatives Enterobakterium welches keine Laktose verwerten kann, da es weiß auf MacConkey (Abb. 7) wächst bzw. bei der Gram-Färbung rosa Stäbchen zeigt (Abb. 10). Außerdem kann es Erythrozyten lysieren (mit Oxidation des Eisens), da es auf Blutagar (Abb. 9) einen grünen Hemmhof bildet (Alpha-Hämolyse).

Bakterium x3 (Abb. 6) ist ein negatives Enterobakterium welches keine Laktose verwerten, da es weiß auf MacConkey (Abb. 8) wächst bzw. bei der Gram-Färbung rosa Stäbchen zeigt (Abb. 11). Außerdem kann es Erythrozyten lysieren (mit Oxidation des Eisens), da es auf Blutagar (Abb. 9) einen grünen Hemmhof bildet (Alpha-Hämolyse).


Versuch E2-Identifizierung von Mikroorganismen aus einem Gemisch

Ziel

Ziel dieses Versuchs ist es 3 verschiedene Bakterien in einem Gemisch anhand von vorher angefertigten Verdünnungsausstrichen auf verschiedenen Nährmedien und mikroskopischen Tests zu bestimmen und zuzuordnen.

Zuerst wurden von allen aufgeführten Bakterien Verdünnungsausstriche auf verschiedenen Nährmedien durchgeführt (Skript S. 13) und einen Tag bei 37°C bebrütet (bis auf Saccharomyces cerevisiae welche auf 30°C für 2 Tage bebrütet wurde).

Zusätzlich wurden von Klebsiella oxytoca eine Kapselfärbung, von Saccharomyces cerevisiae ein Lebendpräperat und von einer Mischung aus Escherichia coli J5 und Staphylococcus aureus eine Gram-Färbung angefertigt. (Skript S. 20 – 21)

Von der bekommenen Mischkultur wurden die Verdünnungen 10-5 bis 10-7 auf CASO-Agar ausplattiert und einen Tag lang bei 37°C bebrütet (Skript S. 14). Von der verdünnten Mischkultur wurden die 3 verschiedene Bakterien als Reinheitsausstriche auf CASO-Agar und MacConkey-Agar ausgestrichen.

Ergebnisse

Die Tabelle (Tab. 2) zeigt auf welchen Nährmedien die verschiedenen Bakterien wachsen und ob sie zur Hämolyse bzw. Lactoseverwertung fähig sind.

Tab. 2: Vergleich der Verdünnungsausstriche (+…Wachstum / -…kein Wachstum)


Stamm

CASO

YPD

MacConkey

Laktose

Hämolyse

E. coli J5

+


+

+

-

S. typhimurium

+


+

-


B. subtilis

+


-

-

+

S. aureus

+


-

-

+

K. oxytoca

+

+

+

+


Saccharomyces cerevisae


+




x1

+


-

-


x2

+


+

+


x3

+


+

+


Bei der Gram-Färbung des Mischpräparates von E. coli J5 und S. aureus sind gramnegative rosa Stäbchen (E. coli J5) und grampositive violette Kokken (S. aureus), welche häufig in Kokkenpaketen auftreten, sichtbar. (Abb. 14) (Zeichnung 3)

Bei der Kapselfärbung erkennt man in der Mitte das blau/violett gefärbte Bakterium um dieses herum befindet sich eine weiße (eigentlich durchsichtige) Kapsel auf einen schwarzen Hintergrund. (Abb. 12) (Zeichnung 4)


Beim Lebendpräparat von Saccharomyces cerevisae erkennt man runde bis eiförmige Bakterien die sich durch das Präparat bewegen (zuerst schneller und mit der Zeit langsamer) und sich mit der Zeit aneinanderheften. (Abb. 13) (Zeichnung 5)

Abb. 13: Lebendpräparat von Saccharomyces cerevisae

Abb. 12: Kapselfärbung von Klebsiella oxytoca


Bei dem Bakterium x2 war nach der Kapselfärbung keine Kapsel sichtbar, dafür aber bei dem Bakterium x3.

Diskussion

Das Bakterium x1 konnte aufgrund seiner Wachstumseigenschaften auf MacConkey nur Bacillus subtilis oder Staphylococcus aureus sein. Da es aber auch zur Hämolyse fähig ist haben wir es als Bacillus subtilis identifiziert.

Das Bakterium x2 konnte da es rot auf MacConkey-Agar wächst und daher Lactose verwerten kann, aber keine Kapsel bei der Kapselfärbung zeigt als Escherichia coli J5 identifiziert werden.

Das Bakterium x3 konnte da es rot auf MacConkey-Agar wächst und daher Lactose verwerten kann und auch eine Kapsel bei der Kapselfärbung hat als Klebsiella oxytoca identifiziert werden.


Ziel

Ziel dieses Versuchs ist es die Lebendkeimzahlbestimmung von Hefe in 1g handelsüblicher Bäckerhefe zu bestimmen.

Durchführung

Mit der vorgefertigten Bäckerhefesuspension (1,0 g/L) wurde eine Verdünnungsreihe bis 10-5 durchgeführt. Die Verdünnungen 10-3 bis 10-5 auf CASO-Agar plattiert und bei 30°C einen Tag lang bebrütet (Skript S. 15). Die so entstandenen Kolonien wurden ausgezählt.

Ergebnisse

Die cfu der Verdünnen lassen sich mit der Formel: cfu/ml= Anzahl der Kolonien/(Volumen [ml]*Verdünnung) berechnen. (cfu= colony-forming unit bzw. Koloniebildende Einheit)

10-3→548 Kolonien→ 548/(0,1*10-3) = 5.480.000 cfu/ml

10-4→58 Kolonien→ 58/(0,1*10-4) = 5.800.000 cfu/ml

10-5→5 Kolonien→ 5/(0,1*10-5) = 5.000.000 cfu/ml

Die folgende Tabelle (Tab. 3) zeigt die Auszählung der Agarplatten und ihre cfu.

Tab. 3: Die Auszählung der Kolonien und ihre cfu/ml


Verdünnungen

Zahl der Kolonien

cfu/ml

Verdünnung 10-3

548

5.480.000

Verdünnung 10-4

58

5.800.000

Verdünnung 10-5

5

5.000.000


Mittelwert = (5.480.000+5.800.000)/2 = 5.640.000 cfu/ml

Um den errechneten Mittelwert auf 1g Hefe zu bringen muss er umgerechnet werden:

1L=1.000ml

5.640.000*1.000=5.640.000.000 cfu/L = 5,64 * 109 cfu/1g Hefe

Antwort: In 1g Hefe befindet sich 5,64 * 109 cfu.

Diskussion

Die Gruppen 4, 6, und 7 haben sehr ähnliche Werte. Die Gruppen 1,2, und 8 unterscheiden sich mit ihnen um 1.000. Daher ist es wahrscheinlich, dass das Mittelwerte nicht umgerechnet wurden bzw. die Werte vor der Umrechnung entnommen wurden. Gruppe 5 unterscheidet sich ebenfalls mit ihrem Ergebnis.

Weil bei dieser gruppe aber nur eine Verdünnung zählbar war, ist das Ergebnis wahrscheinlich ungenau. Die folgende Tabelle (Tab. 4) zeigt die verschiedenen Werte der einzelnen Gruppen.


Tab. 4: Ergebnisse der Gruppen


Gruppe

10-3

10-4

10-5

Ergebnisse

1

5,26*10*6

8*106

n.z

6,63*106

2

2,63*106

n.z

n.z

2,63*106

3





4

5,98*109

7,3*109

n.z.

6,64*109

5

n.z

n.z

57*106

57*106

6

6,71*106

7,2*106

n.z.

6,55*109

7

5,8*106

5*10*6

5,48*106

5,64*109

8

6*106

2,13*106

2,9*106

3,68*106




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