Anleitung Laborbericht Molekulare Diagnostik 746 / ~3½ Jan S. . 2011

Protokoll

Molekulare Diagnostik, Labor

27.04.2009 – 29.04.2009

 

 

 

 

1. Einleitung

 

Im Zuge des Labors wurde ein Microarray-Experiment durchgeführt. Verwendet wurden dafür hMADs-3 Stammzellen bzw. differenzierte hMADs-3 Zellen an unterschiedlichen Tagen der Differenzierung.

Ziel war die unterschiedliche Expression der Gene in den Proben zu untersuchen.

 

2. Probenaufbereitung und Microarray-Hybridisierung

 

Zu Beginn bekamen wir zwei Proben, beide Male die gleiche (Referenzprobe, Gruppe 1). Eine davon soll mit Cy dye 5 und eine davon mit Cy dye 3 gelabelt werden.

 

Aufteilung:

Probe 1 (Referenz) – Cy dye 5 – Maier und

Probe 2 (Referenz) – Cy dye 3 – Lassnig und Krenn

 

2.1 RNA-Isolation aus der Probe

 

Wir erhielten die fertig vorbereitete Probe.

 

2.2 Reverse Transkription und Aminoallyl-Labeling

 

Die Arbeiten wurden laut Standard Operating Procedure MET014_01 mit folgenden Änderungen durchgeführt.

IV. Reagent Preparation wurde ausgelassen, da diese Schritte bereits durchgeführt waren und wir die darin hergestellten Reagenzien zur Verfügung gestellt bekamen.

Ad V. Procedure. Bei 5.1.5 wurde die Inkubation über Nacht, also ca. 21 Stunden durchgeführt.

Bei 5.1.6 wurde die Inkubationszeit auf 17 Minuten erhöht, da sich das Heizgerät beim Hineingeben der Probe noch in der Aufheizphase befand. Die Temperatur beim Hineingeben war 54°C, nach 4 Minuten waren die erforderlichen 65°C erreicht.

Aufgrund eines Missgeschicks bei 5.2.8 ging Probenmaterial verloren. Beim Herausnehmen der Probe aus der Zentrifuge wurde der Inhalt verschüttet. Da beide Proben glücklicherweise Referenzmaterial enthielten (und somit identisch waren) wurden Schritte 5.2.6 bis 5.2.8 ein weiteres Mal durchgeführt, die beiden Proben vermischt und dann, zum Ausgleich der Konzentrationen wieder gleichmäßig aufgeteilt. Mögliche Auswirkungen sind schwächere Fluoreszenzsignale.

Anmerkung zu 5.4.5. In beiden Filtern waren deutlich die Farben des Labelings zu erkennen. Bei Probe 1 (Cy dye 5) war dies blass-bläulich, bei Probe 2 (Cy dye 3) hell-rötlich bis rosa.

Der optionale Schritt 5.5 Analysis of Labeling Reaction wurde nicht durchgeführt.

Bei 5.6 wurde die Proben 45 Minuten in einer Speed-Vac getrocknet und anschließend noch 45 Minuten dort aufbewahrt.

 

2.3 Hybridisierung

 

Es wurde eine automatische Hybridisierung mittels einer Tecan HS400 durchgeführt. Die dafür notwendigen Schritte wurden laut Standard Operating Procedure MET030_01 ohne Veränderungen durchgeführt.

Für die Vorbereitung der Probe aus dem Labeling-Schritt wurden folgende Schritte laut Standard Operating Procedure MET015_03 aus 5.4 Hyridisierung durchgeführt.

Bei 5.4.4. wurden 88µL des bereits vorbereiteten Hybridisierungsbuffer zur ersten Probe hinzugefügt, gut aufgelöst und der Inhalt zur zweiten Probe pipettiert und ebenfalls gut durchgemischt. 5.4.5 und 5.4.6 wurden anschließend durchgeführt, wobei bei 5.4.6 auf den Kühlvorgang verzichtet wurde.

Der Microarray-Chip hatte die Nummer 228856 (HOC 20).

 

3. Analyse

 

Es wurde nach Standard Operating Procedure MET002_00 vorgegangen. Zuerst wurden die Slides mittels  Axon Instruments Microarray-Scanner 4000B eingescannt.  Dieser arbeitet mit zwei Laser, einer mit 532nm für Cy dye 3 und einer mit 635nm für Cy dye 5.

Es waren die Verstärkungsfaktoren für die beiden Farbkanäle zu wählen.  Dabei war darauf zu achten, dass die Bildpunkte nicht im Sättigungsbereich sind, diese aber trotzdem sichtbar und etwa gleich hell abgebildet werden. Hierzu kann das Histogramm betrachet werden. Der vordere Teil von diesem war dem Rauschanteil zuzuordnen, der hintere dem tatsächlichen Signal. Dort soll die Höhe der beiden Kurven etwa gleich sein. Bei uns waren die Verstärkungsfaktoren für 532nm 720 und für 635nm 680.

Abweichung der beiden Faktoren entstehen aufgrund der verschiedenen Eigenschaften der Farbstoffe (Quantenausbeute, UV-Empfindlichkeit, Auto-Fluoreszenz bei grün).

Ein Ausschnitt unseres Scans ist in Abbildung 1 zu sehen.

Danach war das Grid auf die Spots auszurichten. Es gab bereits ein vorgefertigtes Grid, es wurde noch eine Feinjustierung der 48 Blöcke durchgenommen. Danach berechnet die Software automatisch die Position und Größe der Spots. In jedem Block befinden sich außerdem Referenzpunkte, die immer ein Signal liefern.

Die Filterung wurde nach verschienenen Kriterien mittels eines bereits vorgefertigten Filters durchgeführt. Es wurden unter Anderem folgende Spots „geflagt“: Spots mit zu hoher bzw. zu niedriger Intensität, Median und Mittelwert zu verschieden, Hintergrundsignal stärker als Spotsignal.

Nun ist im Scatterplot (532nm über 635nm) eine schöne um 45° geneigte Punktwolke zu erkennen. Dies ist auch erwünscht, da wir Referenz mit Referenz verglichen haben.

 

Abbildung 1. Scan Gruppe 1, Slide 228856

 

Der nächste Schritt nun ist eine Normalisierung der Daten mittels geeigneter Software (ArrayNorm).

Ein Dye-Swap war bei uns nicht erforderlich, da Referenz mit Referenz verglichen wurde.

Anschließend müssen die Daten ausgewertet werden. Dafür sind relevante Informationen geeignet rauszufiltern. Aufgrund der großen Datenmenge kann sich das teilweise als sehr schwer erweisen.

Hierfür können verschiedene Clusteringverfahren (SVM, k-mean, Neuronale Netze und viele andere) verwendet werden. Als Beispiel sind in Abbildung 2 zwei unterschiedliche Cluster, die mittels Genesis erstellt worden sind, zu sehen.

In Abbildung 3 ist die Auswertung nach Zugriff auf Geneontology-Datenbank zu sehen. Dabei sind die Gene nach Funktionsgruppen aufgeschlüsselt.

 

 

 

 

Abbildung 2. Cluster aus Genesis

 

 

 

Abbildung 3. Sortiert nach bekannten funktioniellen Genen