Ruhr-Universität Bochum - Fakultät für Chemie und Biochemie
Praktikum Biochemische Arbeitstechniken:
Versuch F-05: Isolierung von Glykogen aus Leber
Inhaltsverzeichnis
1.Einleitung. 2
2.Durchführung und Beobachtung. 3
3.Ergebnisse. 5
4.Diskussion. 6
5.Literaturverzeichnis. 7
1.Einleitung
Als Glykogen wird eine Speicherform von Kohlenhydraten in tierischen Organismen bezeichnet. Glykogen ist ein wichtiger tierischer Bestandteil des Polysaccharidstoffwechsels (Speicherpolysaccharid), da es dazu beiträgt Zucker in einer nicht osmotisch wirksamen Form direkt in den Zellen des Verbrauchs zu speichern.
Es besteht aus D-Glukose-Molekülen, welche 1,4-glykosidisch miteinander verknüpft und über 1,6-glykosidische Bindungen verzweigt werden. Dadurch bildet sich ein stark verzweigtes und dicht gepacktes Polymer aus, welches osmotisch kaum wirkt im Gegensatz zur freien Glukose.
Glykogen kommt im Cytosol der Zellen in Granula vor, hauptsächlich wird es in Muskel- und Leberzellen gespeichert. Es besitzt eine globuläre Form mit etwa 10 bis 40nm Durchmesser und bis zu 120.000 Glukoseeinheiten und einem Molekulargewicht von 5000 bis 15000 kDa.
In den Granula befinden sich ebenfalls die Enzyme zur Spaltung des Polymers in seine Monomere. Um die gespeicherte Energie wieder zugänglich zu machen, wird Glykogen durch das Enzym Glykogen-Phosphorylase in die Glukosemonomere abgebaut. Dieses spaltet die 1→4-Bindungen im Glykogen.
Die stark verzweigte Struktur mit vielen freien Enden ermöglicht eine sehr schnelle Freisetzung von Glukose in den verbrauchenden Zellen bei erhöhtem Bedarf. Aus der Glukose kann durch Oxidation große Mengen an Energie freigesetzt werden.
(∆G0= -2850 kJ/mol)
Abbildung 1: Glykogenstruktur (Voet/Voet Biochemie, S. 452)
Glykogen kann sowohl enzymatisch (Glykogen-Phosphorylase) als auch sauer gespalten werden. Dabei werden die Etherbindungen zwischen den Glukoseeinheiten gespalten. Eine „Aktivierung“ kann dabei durch ein Enzym oder ein Proton erfolgen.
Beim enzymatischen Abbau werden nur die 1-4-Bindungen gespalten, die Säurehydrolyse betrifft jedoch auch die 1-6-Verknüpfungen (keine Selektivität). Die säurekatalysierte Spaltung von Ethern erfolgt ausschließlich über Hydrolyse (Addition eines Wassermoleküls pro Bindung).
Enzymatisch gibt es zwei Wege: Bei der Verdauung werden Bindungen auch hydrolytisch gespalten, im Intermediärstoffwechsel jedoch (Glykogenspaltung in Muskel- und Leberzellen) über Phosphorylierung. Dabei wird Phosphat zwischen die über Etherbindungen verknüpften Moleküle eingelagert, dabei entsteht dann statt Glukose Glukose-1-Phosphat.
3,5-Dinitrosalicylsäure (3,5-DNS) wird zur quantitativen Bestimmung von reduzierenden Zuckern verwendet. Die Nitrogruppe der 3,5-DNS wird durch den Zucker reduziert, der Zucker dabei oxidiert. Dabei wird eine Aldehydgruppe zur Carbonsäure oxidiert, Ke.....[Volltext lesen]
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Die Lösung sollte ausflocken, jedoch waren keine Flocken sichtbar. Der Tube wurde auf Eis gestellt, bis eine Ausflockung erkennbar war. Es wurde erneut für 5 Minuten bei 2000g zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen.
Der Niederschlag wurde anschließend in 3 Reinigungsschritten gewaschen: Das Pellet wurde resuspendiert in 3 ml Ethanol und die Lösung erneut bei 2000g für 5 Minuten zentrifugiert, der entstehende Überstand wurde abpipettiert und verworfen.
Dieser Schritt wurde noch einmal wiederholt. Nach erneutem Verwerfen des Überstandes wurden 3ml Diethylether dazu gegeben und die Lösung bei 2000g 5 min zentrifugiert. Das Pellet bzw. der Niederschlag war wesentlich lockerer als vorher, beim Abpipettieren des Überstands musste darauf geachtet werden, dass kein Niederschlag mit abgenommen wurde.
Es blieb ein Teil der Flüssigkeit im Tube. Der Rückstand im Tube wurde unter dem Abzug an der Luft trocknen gelassen und danach abgewogen.
Zum Ansetzen der Hydrolyse wurden jeweils 160 mg Glykogen (zwei Mal) abgewogen.
Für die saure Hydrolyse wurden 160 mg Glykogen in 20 ml destilliertem Wasser gelöst. 8 Lösungen wurden in Reagenzgläsern nach folgendem Schema hergestellt:
Tabelle 1: Pipettierschema zur sauren Hydrolyse
Alle Ansätze wurden nach dem Stoppen mit Natronlauge und Zugabe von Dinitrosalicylat 5 Minuten bei 95°C im Wasserbad nochmals inkubiert. Nachdem sie abgekühlt waren, wurden jeweils 10 ml Wasser dazu pipettiert und die Lösung mit Parafilm unter Invertieren gemischt. 1 ml der Lösungen wurden in Küvetten überführt.
Die Extinktion wurde bei 563 nm gemessen.
Für die enzymatische Hydrolyse wurden 160 mg Glykogen in 20 ml Phosphatpuffer gelöst (pH = 6,9). Außerdem wurde etwa 1 ml Speichel mit 40 ml destilliertem Wasser verdünnt und gemischt. Glykogenlösung und Speichellösung wurden nach folgendem Schema zusammen pipettiert:
Tabelle 2: Pipettierschema zu.....
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Die Extinktionsmessung der Hydrolyseansätze dient dazu, den Hydrolysegrad der Probe bestimmen zu können, dabei sind Extinktion und Hydrolysegrad proportional zueinander: Je höher die Extinktion, desto größer der Hydrolysegrad.
Der Ansatz der sauren Hydrolyse mit 25 Minuten Reaktionszeit wird als Wert für den Hydrolysegrad 100% genommen. Der Hydrolysegrad 0 % entspricht dem Leerwert (=0). Der Hydrolysegrad berechnet sich folgendermaßen: (Extinktion : Extinktion S8) x 100 %
Bei der sauren Hydrolyse wurden folgende Extinktionen gemessen:
Tabelle 4: Extinktionen bei der sauren Hydrolyse von Glykogen
Bei der enzymatischen Hydrolyse wurden folgende Extinktionen gemessen:
Tabelle 5: Extinktionen bei der enzymatischen Hydrolyse von Glykogen
Die Werte wurden graphisch in ein Hydrolysediagramm aufgetragen:
Abbildung 3: Hydrolyse von Glykogen
In dem Diagramm ist der zeitliche Verlauf der Hydrolyse von Glykogen aufgetragen.
Die farbigen Kurven (dicker) stellen den realen Verlauf des Hydrolysegrads dar, die schwarzen Linien (dünn) sind die Trendlinien, die den nach den Werten zu erwartenden Zusammenhang zwischen Zeit und Hydrolyse darstellen.
Bei der sauren Hydrolyse erkennt man, dass es sich bei der Reaktion um einen linearen Zusammenhang zwischen Reaktionszeit und Hydrolysegrad handelt. Der Anstieg zwischen 0 und 9 Minuten ist sehr linear, danach flacht die Steigung der Kurve leicht ab bis zum Wert von 15 Minuten, der Anstieg ähnelt dem Anstieg zwischen 0 und 9 Minuten.
Bei der enzymatischen Hydrolyse handelt es sich um einen logarithmischen Zusammenhang. Der Hydrolysegrad ist zwar zunehmend, jedoch nimmt die Steigerung nicht proportional zu, sondern flacht mit der Zeit ab und nähert .....
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Außerdem kann ein Teil des Pellets beim Abpipettieren der Flüssigkeit mit abgenommen worden sein.
Als Literaturwert wird eine Spanne von 1 bis 10 % (Voet/Voet) bzw. 3 bis 5 % (Quelle 5) angegeben.
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