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Biology

University, School

Johannes Kepler Universität Linz - JKU

Grade, Teacher, Year

2, Berger, 2016

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Text by Janine B. ©
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EINFÜHRUNG IN DIE MOLEKULARBIOLOG­IE Aufbau und Struktur der Nukleinsäuren, DNA: DNA ist ein Polymer aus Nukleotiden (Nukleosid mit angeesterter Phosphorsäure). Das C1 der Ribose ist N-glycosidisch mit einer Pyrimiden- bzw. Purinbase verbunden, am C2 der DNA fehlt der Sauerstoff, C3 bindet an Phosphat der vorhergehenden Nukleotids u. am C5 sitzt das Phosphat. Bei physiologischem pH ist das Phosphat-Backbo­ne vollständig deprotoniert. Bei dsDNA bilden Purinbasen mit Pyrimidenbasen H-Brücken aus. Meistens bilden ds Nukleinsäuren…
Physikalische Eigenschaften der Nukleinsäuren Die Fähigkeit der DNA-Einzelsträn­ge sich unter geeigneten Temperatur- und Ionenbedingunge­n wieder zu einem Doppelstrang zusammenzufügen nennt man Renaturierung oder Reassoziation. Die durch die Renaturierung gebildeten Moleküle heißen Hybridmoleküle und den Vorgang der Doppelstrangbil­dun­g Hybridisierung. Wenn sich Hybridmoleküle nicht ganz komplementär paaren kommt es zu Fehlpaarungen, den resultierenden Doppelstrang nennt man Heteroduplex. Dieser ist extrem…

TFIIH phosphoryliert Serin in 5. Position, dadurch pausiert die RNA Pol. so lange, bis das capping enzyme an CTD gebunden ist. Die CTD beginnt dort, wo die RNA heraus kommt, die RNA wird dort vorbeigeführt. Die CTD ist sehr wichtig. Sie kann sich von den TFs lösen, aber es kommt zu einer Pausierung. In den letzten Jahren wurde klar, dass die RNA Pol nach 20-25 nt hängen bleibt, durch die Phosphorylierung.
Negative TFs beeinflussen die Pause.

Erst wenn das Capping-Enzyme (bindet erst wenn Serin an 5. Position phosphoryliert ist) gebunden ist, bindet Elongationsfaktor. Dieser positioniert Serin nun auch an 2. Stelle (Serin auch an 5. Position, wird von TFIIH phosphoryliert). Nun kann die RNA Pol in die richtige Elongation übergehen.
CTD ist in unmittelbarer Nähe vom Exit Channel. Die mRNA wird direkt daran vorbeigeführt.

Splicingfaktoren sitzen auf CTD drauf. Die phosphorylierte CTD ist also eine wichtige Rekrutierungsplattform.

  • CTF/NF1

  • SP1
    GC Box wird erkannt von TF SP1 Zinkfinger Protein. SP1 bindet oft an GC Boxen. Sie treten oft an TATA Box-freien Promotoren auf. SV40 Promotor hat keine TATA Box, dafür SP1 an GC Boxen

  • Oct-1, Oct-2
    Es kommt vor, dass z.B. Oct-2 vorhanden ist, aber kein Oct-1. Die Orientierung muss nicht immer konstant sein, es müssen nicht alle Element gleichzeitig vorhanden sein. Es gibt verschiedenste Kombinationsmöglichkeiten.
    Bindestellen für diese Proteine liegen normalerweise im Bereich von -200 vorm Promotor. Sie sind in der Regel in allen Zellen vorhanden. Oct-2 kommt in cytoplasmatischen Gewebe vor.

  • NFkB
    kB wird von TF NFkB erkannt. NFkB ist wichtig für Entzündungsreaktionen.

    Die genannten Faktoren binden innerhalb vom Promotor. Je nach Promotor treten verschiedene Kombinationen auf, in der Regel sind mind. 2 dieser Faktoren vorhanden. Diese Faktoren können in verschiedenen Abständen und Kombinationen vor dem Promotor liegen (promotor proximal Region; TF Bindestellen bis max. -200 vor dem Promotor).

    Enhancer/Silencer können 10-15 kb vor oder hinter dem Promotor liegen. Enhancer ist eine Erkennungsstelle auf der DNA, die sehr viele Bindestellen für Transkriptionsfaktoren auf sehr engem Bereich hat.
    Die Regulierung erfolgt über Enhancer (sie binden Coaktivatoren und rekrutieren Mediatoren). Enhancer sind trans-acting-Elemente, sind orientierungsunabhängig. Enhancer haben starke Gewebsspezifität (man hat herausgefunden, dass ein Enhancer eine Leberzelle zu einer Leberzelle macht, das gilt auc.....[read full text]

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    1. Aktivierung von Transkriptionsfaktoren

    • Proteinneusynthese
      Dauert eher länger bis TF fertig ist (Stunden). Häufig bei Genen bzw. Proteinen, die für die Entwicklungsphase benötigt werden.

  • Ligandgebunden
    z.B. Steroidrezeptoren; Hormon muss binden, damit der Rezeptor aktiviert wird (Bindung einer niedermolekularen Substanz)

  • Proteinphosphorylierung
    Signalkaskaden lösen Proteinkaskaden aus, die dann zur Phosphorylierung des Transkriptionsaktivators führt

  • Anhängen einer UE

  • Unmasking
    z.B. NFkB (TF) spielt bei Entzündungen eine Rolle. Interleucine zeigen Entzündungen an, über Signalkaskade kommt es zur Dephosphorylierung und NFkB liegt in aktiver Form vor. z.B. Gal4 vergesellschaftet mit Gal80, wenn Gal 80 transkribiert wird, wird TF frei

  • Stimulation von Kernimport

  • Freisetzung von der Membran
    TF sind an Membran gebunden und müssen erst proteolytisch prozessiert werden (Proteolyse, Transmembrandomäne wird gespalten und TF wird frei). Der Rest vom Protein beinhaltet eine DNA-bindende Domäne und transaktivierende Domäne und kann in den Kern gelangen. Z.B bei der Regulation der Sterolsynthese

    1. Kernimport

    Wie kommen TF in den Zellkern?

    Dazu werden Signale in der Peptidkette der zu transportierenden Proteine (NLS = kurze AS-Sequenzen, AG reich, „Kernlokationssignal“ = stretches von basischen AS, z.B. 4 Lys hintereinander; sind zweiteilige Motive – zwei kurze basische Motive, kurzer Spacer, 4 basische AS – Spacer – 4 basische AS) und spezielle Transportine (Importine/Exportine) benötigt, die diese Signale erkennen und Transport vermitteln.
    NLS werden von Importinen erkannt.

    Diese helfen beim Durchtritt durch den Kern hinein. Sie müssen helfen, weil der Kern von einer Doppelmembran umschlossen ist. Die Kernporen sind ausgekleidet mit FG-Proteinen, welche viele repeads beinhalten (hydrophob).
    Es können Moleküle nur bis zu einer Größe von max. 50 kDa durch die Kernporen hindurch. Der Transport von Proteinen wird durch das G-Protein Ran und seinen GTP/GDP Status reguliert. Importin erkennt und bindet an Cargo-Protein und wandert durch die Kernpore. Exportine transportieren Shuttle-Proteine wied.....

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    1. Herstellung des 3`Endes des pre-mRNA Transkripts in Eukaryoten / 3‘-Prozessierung mRNA
      Die 3`Prozessierung wird durch spezifische Motive auf der mRNA vermittelt. Bei eukaryontischer mRNA wird am 3`Ende immer durch einen endonucleolytischen Schnitt „gestutzt“.
      Die RNA Pol liest über die PolyA-Kette drüber. 10-30 nt hinter dem PolyA-Signal ist die PolyA-Site wo geschnitten wird.

      An das PolyA-Signal bindet CPSF, es erkennt das PolyA-Signal: AAUAAA. Ein Stück weiter dahinter, an einer GU-reichen Region (3`von Schnittstelle) bindet CstF (cleavage stimulatory factor). Er stimuliert die 3`Prozessierung.
      CPSF rekrutiert CFII (cleavage factor). CFI und II sind verantwortlich für das Schneiden an der PolyA-Site.
      Damit effizienter geschnitten wird, braucht man PAP (PolyA-Polymerase).

      PAP polymerisiert A und hängt den PolyA-Schwanz dran = Polyadenylierung. Nach ca. 15 A bindet PABII (PolyA-Bindeprotein). PABII bindet während der Synthese an den wachsenden PolyA-Schwanz.
      Der PolyA-Schwanz ist wichtig für die Stabilität der mRNA, und damit die mRNA den Ort der Transkription verlassen kann, sonst würde das Transkript hängen bleiben und degradiert werden (3`Prozessierung daher wichtig).

      Der PolyA-Schwanz ist beim Menschen ca. 200 nt lang, bei der Bäckerhefe ca. 70 nt.
      (Bei Bakterien hört die Transkription auf wenn die RNA Pol zu einem Terminator kommt (rho abhängig/unabhängig), bei Eukaryonten kommt es zur Prozessierung).


    1. Initiation der Transkription bei Eukaryonten (Beteiligte Enzyme, Ablauf usw.)


    Die eukaryontischen RNA-Polymerasen sind eng mit den prokaryontischen verwandt und somit ist der Prozess der Transkription in beiden Fällen fast ident.

    Unterschiede:

    • Eukaryonten besitzen 3 verschiedene RNA-Polymerasen (RNA-Poly I, II, III) während in Bakterien nur eine RNA-Polymerase vorkommt.

    • Eukaryonten benötigen mehrere Initiationsfaktoren (=allgemeine Transkritpionsfaktoren GTFs), Bakterien nur einen (σ-Faktor)

    • In vitro reichen die GTRs zusammen mit der RNA-Polymerase II aus, um die Transkription auf einer DNA-Matrize (ohne Histone) zu initiieren. In vivo liegt die DNA in eukaryontischen Zellen allerdings in Nucleosomen verpackt vor. Unter diesen Bedingungen können die allgemeinen Transkriptionsfaktoren allein nicht an Promotorsequenzen binden und eine signifikante Transkriptionsaktivität hervorrufen.

      Es sind zusätzliche Faktoren notwendig, wie z.B. DNA-bindende regulatorische Proteine, der sogenannte Mediatorkomplex und Chromatin.....

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    Die TAFs bilden einen großen Komplex. Ein kleiner Teil davon bindet an DPE (downstream promotor elements). TFIID (TBP + TAFs) hat eine wichtige Funktion für den Aufbau vom Initiationskomplex.
    An der TATA Box erfolgt die RNA-Pol II Initiationskomplex Assemblierung.
    Die Assemblierung beginnt mit TFIID.
    Ist TFIID gebunden an die TATA Box, binden TFIIB und TFIIA. Sie haben einen stabilisierenden Effekt.

    TFIIB exponiert die richtige Domänen ins aktive Zentrum der RNA Pol, TFIIA stabilisiert.
    Die RNA Pol II liegt gemeinsam mit TFIIF vor. TFIIF bringt die RNA Pol II an den Promotor. Dann erfolgt die Beladung mit anderen TFs. TFIIE hilft bei der Beladung von TFIIH und beeinflusst vermutlich das Supercoiling. TFIIH hat Helicaseaktivität (unterstützt das Aufschmelzen der DNA Übergang vom geschlossenen in den offenen Komplex) und Kinasefunktion – phosphoryliert die C-terminale Domäne von RNA Pol II beim Übergang in die Elongation.

    TFIIH phosphoryliert Serin in 5. Position, dadurch pausiert die RNA Pol. so lange, bis das capping enzyme an CTD gebunden ist. Die CTD beginnt dort, wo die RNA heraus kommt, die RNA wird dort vorbeigeführt. Die CTD ist sehr wichtig. Sie kann sich von den TFs lösen, aber es kommt zu einer Pausierung. In den letzten Jahren wurde klar, dass die RNA Pol nach 20-25 nt hängen bleibt, durch die Phosphorylierung.
    Negative TFs beeinflussen die Pause.

    Erst wenn das Capping-Enzyme (bindet erst wenn Serin an 5. Position phosphoryliert ist) gebunden ist, bindet Elongationsfaktor. Dieser positioniert Serin nun auch an 2. Stelle (Serin auch an 5. Position, wird von TFIIH phosphoryliert). Nun kann die RNA Pol in die richtige Elongation übergehen.
    CTD ist in unmittelbarer Nähe vom Exit Channel. Die mRNA wird direkt daran vorbeigeführt.

    Splicingfaktoren sitzen auf CTD drauf. Die phosphorylierte CTD ist also eine wichtige Rekrutierungsplattform. )


    1. Splicesosom

    (Siehe Frage 36)
    =Komplex der ca. 150 Proteine und 5 RNAs umfasst. Im Verlauf nur einer einzigen Spleißreaktion hydrolysiert eine Spleißosom mehrere ATP-Moleküle. Man geht davon aus, dass viele der Aufgaben von den RNA-Bestandteilen erledigt werden.
    Spleißosome RNAs lokalisieren die Sequenz an Intron-Exon-Grenzen und sind wahrschneinlich auch bei den Sleißreaktionen selbst katalytisch aktiv.

    Spleißosom bringt funktionelle Gruppe in räumliche Nähe, damit Reaktionen von selbst ablaufen können.

    Die 5 RNAs des Spleißosoms (U1, U2, U4, U5 und U6) werden zusammenfassend als kleine nucleäre RNAs (snRNAs) bezeichnet. Jede dieser RNA-Spezies ist bei den meisten Eukaryonten zwischen 100 und 300 nt lang und mit mehreren Proteinen komplexiert. Diese RNA-Proteinkomplexe heißen kleine nucleäre Ribonucleoproteinkomplexe (snRNPs).
    Das Spleißosom ist ein großer Komplex, der aus diesen snRNPs besteht, doch wechselt die genaue Zusammensetzung in den verschiedenen Stadie.....

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    Dadurch entstehen unterschiedliche Proteine. Der Grund warum der Mensch nur 25.000 Gene hat ist, weil das Spleißen große Variabilitätsmöglichkeiten bietet.


    Zusatz:

    Kopplung von Capping, 3`Prozessierung, Spleißen, Export, Transkriptionsintiation

    mRNA liegt nicht nackt vor. Sie liegt 25nt vor ehemaliger Spleißstelle, d.h. mRNA, die erfolgreich gespleißt wurden, tragen einen Komplex der signalisiert, dass erfolgreich gespleißt wurde = exon-exon-junction complex (EJC; ist auch wichtig für den Export aus den Zellkern). EJC erkennen auch mRNAs, die mutiert sind.
    zu Frage 39

    Man hat herausgefunden, dass bei Mutationen das 1. Intron nicht herausgespleißt wird. Nur bei den ersten Introns hilft der Cap-binding-Complex bei der Bindung von U1 an die erste 5`Splice-site. Außerdem hat man noch herausgefunden, dass ähnliches auch für den PolyA-Faktor gilt (aus der 3`Prozessierung). Die letzte Stelle an der Splice-Site wird schlecht erkannt, daher ist der PolyA-Faktor wichtig für die Beladung von U2 an die letzte Stelle der Splice-site.
    Die Beladung von der mRNA mit Spleißfaktoren und mit 3`Prozessierungsfaktoren passiert co-transkriptionell.
    zu Frage 36

    Die C-terminale Domäne (CTD) (aus Transkriptionsinitiation) hat eine wichtige Rekrutierungsfunktion. Sie interagiert mit: Capping-Faktoren, Splicing-Faktoren, Polyadenylierungsfuntkion.
    Vorteile wenn Faktoren zuerst an CTD binden, bevor sie an die mRNA binden: An den splice-sites sind nur ein paar Nukleotide komplementär, deshalb hat es Vorteile wenn CTD unmittelbar in der Nähe v.....

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  • C-Loop – Thymidin kann in tRNA auftreten

  • Variable-Loop – Grund warum tRNA 75-95 nt lang ist

    Funktion:
    Aminosäuremoleküle werden vor ihrem Einbau in ein Protein mit einer Klasse von RNA-Molekülen verknüpft = tRNA. tRNA deswegen, weil der mit ihnen verbundene Aminosäurerest nachfolgend auf die entstehende Polypeptidkette übertragen wird.

    Beladung der tRNA (mit AS)
    Die Beladung erfolgt durch die Amino-Acyl-tRNA Synthetase (aa-tRNA-Synthetase). Das sind Enzyme, die tRNA, ATP, AS binden. Für jede AS gibt es eine aa-tRNA Synthetase. AS wird gebunden und auf AMP übertragen. Damit wird die AS aktiviert – unter Abspaltung von Pyrophosphat.
    Die tRNA wird über den Akzeptorstamm und über Anticodon- und D-Loop-Bereiche erkannt.
    Wenn die tRNA gebunden ist, kommt es zu einem nucleophilen Angriff.

    Die Bindung an der 2`oder 3`OH-Gruppe – letztendlich wird die Bindung isomerisiert und die AS ist immer an 3`OH-Gruppe zu finden.
    Bei falschem Einbau der AS kann es noch zur Hydrolyse kommen (1 von 15000 Fällen wird AS falsch eingebaut).
    aa-tRNA-Synthetasen haben auch ein kinetisches proofreading, d.h. wenn eine falsche AS gebunden ist, kann diese wieder hydrolysiert werden.


    Initiator-tRNA (Beladung – Unterschied)

    Sie wird im Zuge der Initiation verwendet, während andere tRNAs im Zuge der Elongation verwendet werden. Daher haben Initiator-tRNA auch eine andere Struktur:
    ähnlich zur tRNA, aber die Initiator-tRNA von Bakterien wird mit Methionin beladen. Danach erfolgt die Formylierung des Methionins (bei Eukaryonten gibt es nur Methionin, keine Formylierung).
    Die Initiator-tRNA wird nur für die Erkennung des Startcodons verwendet (AUG, selten GUG, UUG).

    .....

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