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Biology

University, School

Johannes Kepler Universität Linz - JKU

Grade, Teacher, Year

2, Berger, 2016

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Text by Janine B. ©
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EINFÜHRUNG IN DIE MOLEKULARBIOLOG­IE Aufbau und Struktur der Nukleinsäuren, DNA: DNA ist ein Polymer aus Nukleotiden (Nukleosid mit angeesterter Phosphorsäure). Das C1 der Ribose ist N-glycosidisch mit einer Pyrimiden- bzw. Purinbase verbunden, am C2 der DNA fehlt der Sauerstoff, C3 bindet an Phosphat der vorhergehenden Nukleotids u. am C5 sitzt das Phosphat. Bei physiologischem pH ist das Phosphat-Backbo­ne vollständig deprotoniert. Bei dsDNA bilden Purinbasen mit Pyrimidenbasen H-Brücken aus. Meistens bilden ds Nukleinsäuren…
Physikalische Eigenschaften der Nukleinsäuren Die Fähigkeit der DNA-Einzelsträn­ge sich unter geeigneten Temperatur- und Ionenbedingunge­n wieder zu einem Doppelstrang zusammenzufügen nennt man Renaturierung oder Reassoziation. Die durch die Renaturierung gebildeten Moleküle heißen Hybridmoleküle und den Vorgang der Doppelstrangbil­dun­g Hybridisierung. Wenn sich Hybridmoleküle nicht ganz komplementär paaren kommt es zu Fehlpaarungen, den resultierenden Doppelstrang nennt man Heteroduplex. Dieser ist extrem…

-35er Region: Consensussequenz TTGACA
interagiert auch mit σ70; Promotoren die möglichst genau dieser Consensussequenz entsprechen sind starke Promotoren

Shine-Dalgarno: Consensussequenz AGGA
ist eine Ribosomenbindestelle; tritt kurz vor dem Starcodon (AUG) auf

Stopcodon: UAA (am häufigsten)
UGA Abbruch der Translation
UAG

(Codons werden als Tripletts gelesen)

Transkriptionstermination: GC – reiche Region + 6-7 U-Reste (am besten daran erkennbar; auf er DNA 6-7 T-Reste!)
Ausbildung eines Transkriptionsterminationshairpin; RNA-Pol fällt ab (terminiert), Transkript wird freigesetzt

Reihenfolge: -35 Region -10 Region (Transkriptionsstartpunkt) S/D Translationsstartpunkt (gegeben) Stopcodons Transkriptionstermination

  1. RNA-Polymerase Aufbau

RNA-Polymerasen, genauer DNA-abhängige RNA-Polymerasen, sind Enzyme (Polymerasen), die die Synthese von Ribonucleinsäuren (RNA) bei der Transkription der DNA katalysieren.

Bei Bakterien gibt es nur eine Form der RNA-Polymerase, die Primase.
Bei Eukaryonten unterscheidet man 3 Formen der RNA-Polymerase: die RNA-Polymerase I, die die Bildungvon rRNA als prä-rRNA (45S wird prozessiert zu 18S; 5,8S; 28S), die
RNA-Polymerase II, die die Bildung der prä-mRNA, snoRNAs (small nucleolar RNAs) und mancher snRNAs (small nuclear RNA) wo siRNA und miRNA katalysiert, und die
RNA-Polymerase III, die die Bildung von tRNA, 5S rRNA, 7SL-RNA, einiger snRNAs und anderer kleiner RNAs katalysiert.

Prokaryonten: 465 kD groß, bestehend aus 2 α-UE (jede 40kD), einer β-UE (155kD), β`-UE (160kD), einer σ-UE (.....[read full text]

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  • Bakterielle Promotor in -10, -35 Region (Aktivator z.B. CAP) core promotor kann TATA Box, Inr, DPE, BRE beinhalten

    • RNA-Pol III: transkribiert die tRNA, im Nucleoplasma



    1. Transktioptionstermination in Prokaryonten

    Es gibt 2 Arten von Termination:

    1. Intrinsische, Rho unabhängige Termination

    (abhängig von Haarnadelstruktur); diese wird bestimmt durch einen GC-reichen Hairpin und einer Folge von 6-7 U-Resten (weil diese die Pausierung beeinflussen).
    Die U-Reste sind wichtig, sonst kann die Struktur nicht als Termintator wirken. Die Ausbildung der Haarnadel kann nur erfolgen, wenn die RNA schon ausgebildet ist.
    Die RNA Pol gelangt bis zu den U-Resten. Es kommt zur Pausierung der Ausbildung der RNA Pol.

    Die Pausierung dauert ca. 1,5 sek. an der Heteroduplexbindestelle und upstream-RNA-Bindestelle. Je länger die Pausierung dauert, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass sich eine Terminationsstruktur ausbildet.
    Die Transkriptionsblase kollabiert.

    Wenn im aktiven Zentrum der RNA Pol eine Hairpinstruktur auftritt, führt das dazu, dass die RNA Pol. terminiert und abfällt.
    Das Transkript wird freigesetzt.


    Unterstützt wird das z.B. von NusA Protein. Es stimuliert den Hairpin durch Schwächen der Kontakte zwischen der Schlinge des Hairpins, indem es an der niederaffinen RNA Bindestelle sitzt und die RNA dort somit nicht gebunden werden kann. Ebenso wird die Pausierung am Terminationspunkt durch NusA verlängert.


    1. Rho .....

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    Das lac-Operon wird sowohl negativ durch einen Repressor, als auch positiv durch einen Aktivator reguliert. Zusätzlich kontrolliert der Mechanismus des Induktor-Ausschlusses (inducer exclusion) die Aktivität der Lac-Permease. Diese drei Regulationen bewirken, dass Lactose erst dann, wenn es keine effizientere Alternative gibt, verstoffwechselt werden kann.


    1. CAP, lac-Genaktivator (Klasse 2 abhängige Promotoren + Mechanismus)

    Siehe Frage 25

    CAP ist ein helix-turn-helix bindenden Motiv. Es muss als Dimer vorliegen, damit es in die große Furche passt. Abstand zwischen HTH passt nur, wenn es an cAMP gebunden ist. CAP interagiert mit der Untereinheit der RNA Polymerase, mit der C-terminalen Domäne. Die C-terminale Domäne interagiert mit den Up-Elementen und mit CAP. CAP hilft der RNA-Polymerase an die DNA zu binden, es kommt zur verstärkten Transkription.


    1. Was ist am 5‘-Ende der mRNA bei Bakterien?

    Es gibt einen Bereich, der transkribiert aber nicht translatiert wird, nämlich die 5`UTR (untranslated region). Sie ist ca. 20 nt lang, kann aber auch bis zu 300 nt lang sein (wenn das der Fall ist, ist das ein Zeichen, dass der Regulator im Gang ist). In der 5`UTR ist auch die Shine-Dalgarno-Sequenz. Sie ist eine Ribosomenbindestelle, so dass AUG in der p-site bindet.


    Fragen zu Kapitel 8- transkription von eukaryontischen Promotoren


    1. Abbau und Stabilität für mRNA. (mi-RNA und RNAi)

    mRNA – Abbau und Stabilität in Eukaryonten

    Die mRNA Menge wird durch den Abbau strikt reguliert. Der Abbau kann von 5`nach 3` oder von 3`nach 5` erfolgen und endonucleolytische Schritte beinhalten (RNA Abbau in Prokaryonten: RNAase E und von 3`nach 5`)
    5`Cap und die Länge des PolyA-Schwanzes sind sehr wichtig.
    M.....

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    Dies ergibt die pre-miRNA (die pre-miRNA wird durch ein Transportsystem ins Cytoplasma geschleust. Sie wird im Cytoplasma durch den Dicer (ist eine RNAse) prozessiert).
    Der Dicer spaltet in kurze Nucleotide, die einen 3`Überhang aufweisen (von 2 nt). miRNA Duplex wird in einen Proteinkomplex integriert (=RISC). Der 2. Strang (der 1. Strang wird degradiert) bleibt am RISC gebunden, er wird als guide Strang bezeichnet.

    Er detektiert, welche mRNA abgebaut werden soll.
    Wenn es eine vollständige Basenpaarung mit der Ziel-mRNA gibt, wird die Ziel mRNA geschnitten und degradiert. Wenn er vollständig ident ist, erfolgt der Abbau der mRNA. Wenn es keine vollständige Basenpaarung gibt, wird die Translation inhibiert. (also: wenn alle nt komplementär sind, wird die Ziel-mRNA geschnitten und degradiert, bei Missmatches erfolgt die Translationshemmung). miRNAs können auch verschiedenen mRNAs binden.

    Sie binden in 3`nichttranslatierter Region. Entweder kommt es zur Degradation, oder sie verhindern, dass sie translatiert werden.
    Ca. 60% der humanen Gene werden durch miRNAs reguliert.


    Es gibt auch noch RNAi (RNA interference) für das posttranskriptionelle silencing von Genen. Sie ist ähnlich zur microRNA, aber man hat doppelsträngige RNA vorliegen, d.h. man hat 100%ige Komplementarität (keine missmatches).
    Diese Methode wird in der Molekularbiologie zur Abschaltung und Funktionsuntersuchung von Genen in Säugern extensiv verwendet.
    Wie schon erwähnt, geht die Methode von einer doppelsträngigen RNA aus.
    Diese wird ebenfalls in kurze RNA Fragmente geschnitten (21.23 nt lang) und es gibt wieder einen 3`Überhang.

    Das Produkt vom Dicer ist siRNA, welche auch in RISC integriert wird. Ein Strang wird degradiert und der guide Strang bleibt zurück, der die Ziel-mRNA erkennt und danach abgebaut wird.
    Man nimmt an, dass sich dieses System von der Virusabwehr ableitet. Der Mechanismus ist wichtig in der Molekularbiologie um Gene abzuschalten (siRNA wird in Säugerzellen dazu transfektiert, siRNA wird aufgenommen in RISC, dies schaltet Ziel mRNA aus). = RNAi-Methode (siRNA kann man kaufen und entwerfen lassen).

    *Vanessa:
    Die kleinen RNAs tragen, je nach Ursprung, unterschiedliche Bezeichnungen. Die künstlich erzeugten und die in vivo aus doppelsträngigen Vorläufermolekülen gebildeten werden für gewöhnlich kleine interferierende RNAs (siRNAs) genannt. Eine andere Gruppe regulatorischer RNAs sind die Mikro-RNAs (miRNAs). Letztere leiten sich von den Vorläufermolekülen ab, die von Genen codiert und in Zellen exrpimiert werden, in denen die prozesiserten miRNAs ganz bestimmte regulatorische .....

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    Der nächste Schritt ist die Umlagerung des A-Komplexes unter räumlicher Zusammenführung aller drei am Spleißvorgang beteiligter Molekülstellen der prä-mRNA. Dies wird wir folgt erreicht: Die snRNPs U4 und U6 treten, zusammen mit dem U5-snRNP, zu dem Komplex hinzu. Diese 3 snRNPs werden als Tri-snRNP-Partikel bezeichnet. In diesem Partikel werden die Komponenten U4 und U6 durch komplementäre Basenpaarung ihrer RNA Anteile zusammengehalten; das U5-snRNP ist über Protein/Protein-WW lockerer mit dem restlichen Komplex assoziiert.

    Mit dem Eintritt des Tri-snRNPs geht der A-Komplex in den B-Komplex über.

    Im nächsten Schritt verlässt U1 den Komplex. Sein Platz an der 5‘-Spleißstelle wird von U6 eingenommen. Dazu ist es erforderlich, dass die Basenpaarung zwischen der U1-snRNP und der prä-mRNA aufgehoben wird. Erst dann kann die U6-RNA sich an denselben Bereich anlagern.

    Die nächste Umlagerung löst die chemische Katalyse aus und geht wie folgt vonstatten: U4 wird aus dem Komplex entlassen und mach so den Weg für die WW von U6 mit U2 frei (RNA:RNA Basenpaarung). Erst diese als C-Komplex bezeichnete Anordnung erzeugt das katalytisch aktive Zentrum.
    Nach Ausbildung des aktiven Zentrums liegt der Verzweigungspunkt der 5‘- Spleißstelle der prä-mRNA gegenüber, was die Umesterung erleichtert.

    Die zweite Reaktion zwishcen einer 5‘- und einer 3‘-Spleißstelle wird vom U5-snRNP unterstützt. Dieser Komplex ist dabei behilflich, die beiden Spleißstellen räumlich zusammenzubringen. Der finale Schritt ist die Freisetzung der mRNA (Reaktionsprodukt) und des snRNP. Das snRNP ist anfänglich an das Lasso gebunden, steht aber nach dem enzymatischen Abbau dieses RNA-Stücks für neue Raktionen zur Verfügung.


    Zusammenfassend:

    1. Bindung von U1SnRNP an 5`Splice-Site, dabei braucht man oft Hilfssfaktoren, wie z.B. ASF/SF2 (alternativer Splice-Faktor)

    2. Kurz danach bindet U2AF, hilft bei der Beladung von U2 mit U2snRNP, U2AF hilft auch bei der Bindung von U2 an die Verzweigungsstelle – es ist ein Dimer (2UE), eine UE bindet an die 3`Splice-Site, da andere UE bindet an eine Pyrimidinreiche Region

    3. Trimer aus U4, U5, U6 bindet. U4 paart direkt mit U6 (U4 eigentli.....

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    Bei niederen Eukaryonten, die kurze Introns haben, wird das Spleißosom über Introns aufgebaut. Der alternative Splice wird über SR Proteine reguliert, welche bei der Beladung von Spleißfaktoren helfen. Das Splicing wird durch das Spleißosom durchgeführt.
    Aufbau des Spleißosoms: besteht aus snRNPs. Dabei spielen 5 uRNAs/snRNAs eine Rolle: U1, U2, U4, U5, U6 (sie heißen U weil sie relativ U-reich sind).

    Sie bilden die snRNPs, welche verantwortlich sind, das 5`und 3`Splice-site richtig positioniert werden. Bsp. U1sn bildet U1snRNP.



    1. Welcher Transkriptionsfaktor übersetzt housekeeping-Gene in Prokaryonten (am Beispiel E. coli)? Welche Transkriptionsfaktoren gibt es allgemein? Welche Elemente beeinflussen Transkription sonst noch?


    Unter house-keeping genes (Haushaltsgene) versteht man Gene, deren Produkte für den Zellerhalt grundsätzlich notwendig sind. Dazu gehören z.B. die Enzyme des Energiestoffwechsels und die meisten Strukturproteine. Da diese Genprodukte ständig in gleich bleibender Menge bereitgestellt werden müssen, werden die entsprechenden Gene weitgehend unabhängig von anderen Einflüssen auf relativ konstantem Niveau transkribiert.

    Man spricht in diesen Fällen auch von konstitutiver Genexpression.Von den etwa 80.000 Genen des Mausgenoms sind etwa 9.000 Haushaltsgene. Beispiele sind die Gene für die Enzyme Hexokinase und Aldolase, die an Umsetzungen innerhalb der Glycolyse beteiligt sind, und das Strukturprotein Actin. Im Gegensatz zu diesen house-keeping genes werden viele andere Gene nur unter bestimmten Bedingungen, etwa in Abhängigkeit des Nährstoffangebotes oder anderer Umweltbedingungen transkribiert.
    Die Genexpression dieser Gene wird nicht durch Induktion/Repression kontrolliert sondern durch Signale induziert (im Gegensatz zu so genannten adaptiven Genen).

    Ein Haushaltsgen (auch englisch housekeeping gene, nicht-reguliertes Gen, konstitutiv exprimiertes Gen) ist ein Gen, welches unabhängig von Zelltyp, Zellstadium und äußeren Einflüssen exprimiert wird, im Gegensatz zu .....

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