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Biology

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Johannes Kepler Universität Linz - JKU

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2, Berger, 2016

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Text by Janine B. ©
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EINFÜHRUNG IN DIE MOLEKULARBIOLOG­IE Aufbau und Struktur der Nukleinsäuren, DNA: DNA ist ein Polymer aus Nukleotiden (Nukleosid mit angeesterter Phosphorsäure). Das C1 der Ribose ist N-glycosidisch mit einer Pyrimiden- bzw. Purinbase verbunden, am C2 der DNA fehlt der Sauerstoff, C3 bindet an Phosphat der vorhergehenden Nukleotids u. am C5 sitzt das Phosphat. Bei physiologischem pH ist das Phosphat-Backbo­ne vollständig deprotoniert. Bei dsDNA bilden Purinbasen mit Pyrimidenbasen H-Brücken aus. Meistens bilden ds Nukleinsäuren…
Physikalische Eigenschaften der Nukleinsäuren Die Fähigkeit der DNA-Einzelsträn­ge sich unter geeigneten Temperatur- und Ionenbedingunge­n wieder zu einem Doppelstrang zusammenzufügen nennt man Renaturierung oder Reassoziation. Die durch die Renaturierung gebildeten Moleküle heißen Hybridmoleküle und den Vorgang der Doppelstrangbil­dun­g Hybridisierung. Wenn sich Hybridmoleküle nicht ganz komplementär paaren kommt es zu Fehlpaarungen, den resultierenden Doppelstrang nennt man Heteroduplex. Dieser ist extrem…
  • Helix-turn-Helix Proteine binden als Dimer in der großen Furche und haben Balindromische Erkennungssequenzen. Die Erkennungshelix wird in die große Furche gedrückt und erkennt so über H-Brückenwechselwirkung

  • Bei den Zink-Koordinierten Proteinen sorgen die Zinkfingerproteine für eine bessere Spezifität. Es werden mehrere Zinkfinger hintereinander geschaltet (bis zu 30 Zinkfinger). Je mehr Zinkfinger desto höher die Spezifität. Zink dient zur Stabilität.

  • Bei den Zipper-hältigen Proteinen erfolgt die DNA-Erkennung in der großen Furche durch basische Reste am N-Terminus. BSP: Leucin-Zipper (Leucinreste halten Dimer zusammen)

  • β -Faltblatt-Proteine (TBP) binden in die kleine Furche, da dort zusätzliche Faktoren sind, die die Funktion von der TATA-Box beeinflussen. TBP binden mit einer β-Sheet-Struktur. Die β-Stränge beinhalten Phenylalaninreste, welche in die DNA eingeschoben werden, daher wird die DNA stark gekrümmt (es bildet sich eine sattelförmige Struktur aus).

  • β -Hairpin-Proteine binden über antiparallele β-Sheets in die kleine Furche.

Histonproteine:
Um sie wird die DNA gewunden und über H1 fixiert. Bindet an allen Stellen der DNA und macht eine Perlschnur. Muss bei Bedarf auch wieder weiter wandern können – darf also nicht spezifisch binden.
Um die Histonproteine wird die DNA gewunden und über H1 fixiert. Histone sind organisiert durch ein Octamer basischer Proteine in einer Perlenkettenartigen Struktur.

Diese Formen einen Innenkern, bei dem die DNA an der Oberfläche liegt.
Core Histon Monamere besitzen eine 3 Helix-Domäne, die durch loops separiert sind = „histon fold“, das ist eine zentrale, lange Helix, flankiert durch einen Loop und einer kurzen Helix. Über die Loop-Struktur erfolgt die Interaktion mit der DNA (in der kleinen Furche; hat viel weniger Information, unspezifische DNA-Bindung).
Die DNA Monomere (H2A, H2B, H3, H4) liegen als Dimer vor.

Jedes Histon-Dime.....[read full text]

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  • Region 1.1 – verhindert, dass der σ70-Faktor alleine bindet (muss zuerst mit der RNA-Pol. interagieren); Region 1.1 legt sich über die Helix-turn-Helix des σ-Faktors und maskiert diesen

  • Region 2.4 – interagiert mit -10er-Region

  • Region 4.2 – interagiert mit -35er-Region

  • Das sind konservierte Regionen (=fast gleiche AS-Sequenz zwischen den Organismen; wichtige Region)

σ 32 dient der Hitzeschockregulation und wird vom rpoH (Gen) reguliert. Bei zunehmender Hitze löst sich die Sekundärstruktur der mRNA des σ32 auf (Bereich liegt einzelsträngig vor) und das Protein wird translatiert. σ32 initiiert die Expression der Hitzeschockgene.
Regulation σ32: σ32 wird über die Transkription reguliert. rpoH ist das Gen von σ32. Man hat herausgefunden, dass eine erhöhte Transkription nicht zu einer Erhöhung der Expression von σ32 führt.
σ32 hat eine Ribosomenbindestelle in einer Sekundärstruktur, daher wird die mRNA vom Ribosom auch nur schlecht erkannt und führt dazu, dass σ32 nur schlecht translatiert wird (Regulation der Translation auch über Sekundärstruktur).
Regulation durch Proteolyse: σ32 hat nur eine kurze HWZ (30 sek.). Grund dafür ist, dass rasch abgebaut wird.

Verantwortlich für die kurze HWZ ist das DnaK Protein, welches an σ32 bindet und es an ftsH bringt. Wenn die Temperatur erhöht wird, denaturieren auch andere Proteine. Dank versucht, die anderen Proteine in eine normale Faltung zu bringen und hat keine Zeit mehr, sich um σ32 zu kümmern, daher wird σ32 nicht mehr so schnell abgebaut.
Dabei werden hydrophobe Bereiche nach au0en exprimiert.

Diese werden von Chaperones erkannt. Die Folge davon ist, dass σ32 viel langsamer abgebaut wird. Die HWZ steigt und mit verstärkter Translation hat man viel σ32 in der Zelle. σ32 bindet RNA Pol.
Es gibt auch einen Feedback-loop: wenn zu viel σ32 vorhanden ist, kommt es zur verstärkten Bindung von DnaK und ftsH. Das führt dazu, dass mehr Chaperones gebildet werden und es zu einem Abbau von σ32 .....

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Aktivator bindet an UAS. UAS kann im Fall des σ54 sehr weit vom Promotor entfernt sein (normalerweise sind bakterielle Aktivatoren max. im Bereich von -54 vom Promotor entfernt und nicht 1000ende Nucleotide). UAS werden als Enhancer bezeichnet (gibt es in Bakterien normalerweise nicht). Proteine die an den Enhancer binden, nennt man enhancer-binding-proteine (EBP, =Aktivator; sind AAA-Proteine).

Sie falten andere Proteine in einem ATP-abhängigen Prozess (interagieren auf einer Seite mit UAS). EBP muss an Enhancer binden, da er mehrere 1000ende Nucleotide weg ist. Daher kommt es zur Ausbildung eines Loops. Es kommt so zum direkten Kontakt zwischen σ54 und dem Aktivator (ATP-abhängig). Dabei muss es zu einer ATP-Hydrolyse kommen, damit es zu einem Übergang vom geschlossenen in den offenen Komplex kommt.

Der Grund: damit es zu einem erleichterten Aufschmelzen der DNA durch σ54 kommt.

σ28 – für Flagellenexpression

σF – für Flagellenexpression

fec1 – für Eisenaufnahme

rpoS – generelle Stressantwort (Übergang in stationäre Phase)


  1. Regulation von lac und trp Operon wenn Tryptophan und Laktose bzw. Glukose vorhanden ist. Was sind cis und trans-acting Elemente, Beispiele nennen. / Lac Operon und Trp Operon vergleichen.

Lac Operon

Die 3 lac-Gene lacZ, lacY, lacA liegen im Genom direkt hintereinander und bilden das lac-Operon. Der lac-Promotor der stromaufwärts von lacZ liegt, kontrolliert die Transkription des Operons.
Kann auf 2 verschiedene Arten reguliert werden: 1. Modus ist die negative Kontrolle (in Abhängigkeit von lacI-Repressor) und 2. Modus führt über die positive Kontrolle.

  1. Positive Kontrolle

Regulation über CAP (catabolic activator protein). CAP ist abhängig vom Vorhandensein der Glucose. Wenn Glucose nicht vorhanden ist, wird cAMP gebildet, welches ein Rezeptorprotein bindet.
Wenn Glucose vorhanden ist, ist CAP inaktiv. Wenn CAP aktiv ist, bindet es an Genen, die alternative C-Quellen generieren können.
D.h. CAP liegt normalerweise in inaktiver Form vor und bindet nicht an die DNA.

Es wird erst durch die Bindung von cAMP (ist ein Hungersignal in Bakterienzellen; wird gebildet wenn wenig Glucose vorhanden ist), welches durch die Adenylatcyclase gebildet wird, aktiv. CAP-cAMP bindet dann an den Promotor an die CAP-Stelle (Erkennungssequenz)* und fördert so die Bindung von RNA-Polymerase an den lac-Promotor, d.h. CAP-cAMP hilft bei der Rekrutierung/Bindung von RNA Pol mit σ-Faktor.

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  1. Negative Kontrolle

Über lacI kommt Signal der Laktose herein. LacI ist nicht Teil des lac-Operons!! (liegt nur zufällig vor lac-Operon. Es ist ein Protein, das trans-aktiv ist)
LacI codiert für den lac-Repressor und hat einen eigenen Promotor. LacI wird konstitutiv exmprimiert, d.h. egal welche Bedingungen vorliegen, lacI wird immer in gleicher Menge hergestellt. LacI bildet ein aktives Repressorprotein, das bei -82 bindet.
Lac-Repressor bindet immer mind. 2 Operatoren (3 Operatoren sind vorhanden: -82, +11, +420).

Wenn nur 1 Operator, hätte man eine Repression von Faktor 18.
Hexamer bildet sich aus. Bindung von Induktor (Allolaktose) führt zu einer Rotation. Der lac-Repressor fällt von der DNA ab.

Der lac-Repressor hat ein Helix-turn-Helix Motiv. Er muss als Dimer an die DNA binden. Wenn er an die DNA gebunden ist, erfolgt die Dimerisierung über die Helix. Wenn IPTG oder Allolaktose vorhanden sind (IPTG kann anstelle von Allolaktose verwendet werden, ist ein künstlicher Induktor), binden sie zwischen den beiden core-Domänen. Das führt zu einer geringen Rotation von 10°.

Dadurch kann die H-T-H nicht in die große Furche binden, dadurch kann der Repressor auch nicht an die DNA binden (verursacht durch die Allolaktose/Induktor = allosterische Bindung).

Lac-Operon in Abwesenheit von Laktose:

Der lac-Repressor sitzt auf dem Operator (inaktiv). Es kommt zur konstitutiven Transkription. Repressorproteine werden gebildet. Diese helfen sich an den Operator (lacO) und verhindern die Transkription der mRNA. Die RNA kann zwar an den Promotor binden, wenn der Repressor aber an den Operator gebunden ist, kann die Transkription nicht initiieren.

Lac-Operon in Gegenwart von Laktose:

Der lac-Repressor dissoziiert ab. In Gegenwart von Laktose wird der lac-Repressor inaktiviert, weil die Allolaktose (bei der Spaltung von beta-Gallactosidase (lacZ) wird Allolaktose neben Glucose und Galaktose gebildet) an den lac-Repressor bindet.
Die Allolaktose ist eigentlich ein Induktor für LacI und bindet an den lac-Repressor. Dieser wird inaktiv und fällt ab.

Es kommt zur Transkription des lac-Operons.
Die Permease nimmt Laktose aus dem umgebenden Medium auf und transpo.....

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Bei Anwesenheit von Tryptophan kommt es zur 2. Regulationsebene = Attenuation.
Dieser Regulationsmechanismus trifft Entscheidungen darüber, ob das Transkript verlängert oder frühzeitig abgebrochen wird.
Die Leader-Region hat Einfluss auf die Ebene der Transkriptionselongation. Wenn der Operator nicht vom trp Repressor besetzt ist, wird ein Transkript gebildet. Es wird über die trp-Sequenz gelesen (26 nt vor Startcodon).

Die RNA wird synthetisiert und kann translatiert werden in ein kurzes Leaderpeptid. Das Leaderpeptid besteht aus 14 Codons und davon sind 2 Tryptophancodons (direkt hintereinander).
Wenn wenig Tryptophan vorhanden ist, sind wenige tRNAs mit Tryptophan beladen, d.h. die Ribosomen bleiben hängen bei diesen Tryptophancodons. Wenn sie hängen bleiben, bildet die Leader-mRNA eine große Sekundärstruktur aus.

Der rho unabhängige Faktor kann sich nicht ausbilden (Transkriptionsterminationshairpin bildet sich nicht aus).
Wenn viel Tryptophan vorhanden ist, liest das Ribosom rasch darüber und bleibt beim Stopcodon hängen (RNA Pol. wird terminiert).
In der Zwischenzeit ist ein Teil von der Sekundärstruktur vom Stopcodon bereits aufgelöst. Die Ausbildung vom rho-unabhängigen Faktor ist nun möglich, d.h. der Transkriptionsterminationshairpin kann sich ausbilden – rho unabhängige Termination.

Die Transkription terminiert.

Trp-Operon in Abwesenheit von Tryptophan:

In Abwesenheit von Tryptophan ist er Repressor inaktiv und kann nicht am Operator binden. Die Transkription kann beginnen und es wir eine mRNA mit leader-Region und trp-Genen gebildet.
Beispiel trp-Operon von E.coli: es sind 5 Strukturgene (trpE, D, C, B, A – Operon) die hintereinander geschaltet sind.


trans-acting-Elemente: Beeinflussung von einer anderen Stelle aus, z.B. Regulatorproteine, Repressoren, etc.
Kann 2 Operator beeinflussen. Regulator wirkt für verschiedene DNA-Stellen. Die meisten Proteine in der DNA auf trans.

cis-acting-Elemente: wirkt nur dort, wo er selbst ist, funktioniert nur wenn es direkt an Gen angeschlossen ist, z.B. Operator.


  1. Initiation der Transkription bei Bakterien und Aufbau der RNA Pol. / Initiation der Transkription von Bakterien. Welche Faktoren sind wichtig? Unterschied am Promoter bei "Heat shock".

Initiation der Transkription bei Bakterien

Anfängliche Bindung der RNA-Pol. an einen Promotor, wobei ein geschlossener Komplex gebildet wird.
Zuerst liegt ein geschlossener Komplex aus Holoenzym und doppelsträngiger DNA vor.
Durch Aufschmelzen der DNA, Template Strang im aktiven Zentrum* bildet sich ein offener Komplex.
Durch den Übergang vom geschlossenen in den offenen Komplex wird der Matrizenstrang der DNA freigelegt.

Deswegen können nur die ersten beiden nt in das aktive Zentrum der RNA-Pol. eingeschleust werden, dort über korrekte Basenpaarung mit den ersten beiden Positionen der codierenden Region des Matrizenstranges assoziieren und zu einem Dinucleotid verknüpft werden (bis abortive Initiation überwunden).
Das Aufschmelzen geht sehr schnell (1/10 bis 1/1000 sek.) und benötigt eine Helicase (es ist eine Eigenschaft der RNA Pol und wird vom σ.....

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  • Trigger-Loop: wichtig für den korrekten Einbau des Nucleotids. Die trigger-loop ist sehr flexibel, macht strukturelle Veränderungen und kann nur in geschlossener Form vorliegen. Katalysiert wird durch Mg2+ (metallkatalysierte Reaktion), nucleophiler Angriff von 3`OH auf alpha-Phosphat.

    Unterschied am Promotor bei „heat shock“: (siehe Frage 24 (σE, σ32))
    Das bakterielle RNA-Polymerase-Kernenzym kann die Transkription im Prinzip an jedem beliebigen Punkt eines DNA-Moleküls beginnen. Diese Fähigkeit kann in vitro mithilfe eines aufgereinigten RNA-Polymerase-Kernenzyms demonstriert werden. In Zellen erfolgt die Initiation der Transkription allerding ausschließlich an Promotoren.

    Das RNA-Polymerase-Kernenzym (α2ββ‘ω) wird in vivo nämlich durch die Assoziation mit einem Transkriptionsfaktor namens σ in eine Form umgewandelt, in der es die Transkription nur an einem Promotor initiieren kann. Dieser σ-haltige Enzymkomplex wird als RNA-Polymerase-Holoenzym bezeichnet.
    Im Fall von E.coli wird der vorherrschende σ-Faktor σ70 genannt.

    Promotoren, die durch das σ70 –haltige RNA-Polymerase-Holoenzym erkannt werden, weisen zwei charakteristische Sequenzen auf, die 6 nt lang, mehr oder weniger stark konserviert und durch einen Abschnitt aus 17-19 unspezifischen nt getrennt sind. Das Zentrum dieser beiden definierten Sequenzen liegt etwa 10 bzw. 35 nt stromaufwärts vom Transkriptionsstartpunkt (=-35- und -10-Region).

    Die große Mehrheit der Promotoren, die durch den σ70 Faktor erkannt werden, enthält eine erkennbare -35 und -10-Region, aber die Sequenzen dieser Regionen sind nicht bei allen Promotoren identisch. Durch den Vergleich vieler Promotoren konnte eine so genannte Konsenussequenz für die Erkennung durch das σ70 –RNA-Polymerase-Holoenzym abgeleitet werden. Promotoren werden im Allgemeinen umso stärker bezeichnet, je mehr ihre Sequenz mit der Konsensussequenz übereinstimmt. (Stärke=wie oft die Synthese eines RNA-Transkripts an diesem Promotor initiiert wird).

    Die Promotorstärke wird dadurch beeinflusst, wie gut der Promotor anfänglich das RNA-Polymerase-Holoenzym binden kann, wie effizient er die Isomerisierung unterstützt und wie leicht sich die Polymerase ablösen kann, um in die Elongationsphase überzutreten.


    RNA Pol-Aufbau: sieh.....

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