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Biology

University, School

Johannes Kepler Universität Linz - JKU

Grade, Teacher, Year

2, Berger, 2016

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Text by Janine B. ©
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EINFÜHRUNG IN DIE MOLEKULARBIOLOG­IE Aufbau und Struktur der Nukleinsäuren, DNA: DNA ist ein Polymer aus Nukleotiden (Nukleosid mit angeesterter Phosphorsäure). Das C1 der Ribose ist N-glycosidisch mit einer Pyrimiden- bzw. Purinbase verbunden, am C2 der DNA fehlt der Sauerstoff, C3 bindet an Phosphat der vorhergehenden Nukleotids u. am C5 sitzt das Phosphat. Bei physiologischem pH ist das Phosphat-Backbo­ne vollständig deprotoniert. Bei dsDNA bilden Purinbasen mit Pyrimidenbasen H-Brücken aus. Meistens bilden ds Nukleinsäuren…
Physikalische Eigenschaften der Nukleinsäuren Die Fähigkeit der DNA-Einzelsträn­ge sich unter geeigneten Temperatur- und Ionenbedingunge­n wieder zu einem Doppelstrang zusammenzufügen nennt man Renaturierung oder Reassoziation. Die durch die Renaturierung gebildeten Moleküle heißen Hybridmoleküle und den Vorgang der Doppelstrangbil­dun­g Hybridisierung. Wenn sich Hybridmoleküle nicht ganz komplementär paaren kommt es zu Fehlpaarungen, den resultierenden Doppelstrang nennt man Heteroduplex. Dieser ist extrem…

6. Schritt: (Cdk Aktivierung signalisiert Eintritt in die S-Phase) 2 Kinasen spielen eine wichtige Rolle im Anschalten der Initiation der DNA Replikation während der S-Phase. Eine davon ist Cdk. In einzelligen Organismen ist eine Cdk zuständig für den Zellzyklusübergang. In mehrzelligen Eukaryonten ist der Zellzyklus kontrolliert durch mehrere Cdks. Die andere S-Phase-vorantreibende Kinase ist Cdc7, welche als nicht katalytische UE Dbf4 für ihre Stabilität benötigt.

Dbf4 interagiert mit dem replication origin (ORC).

7. Schritt: Nach dem ersten Entwinden der DNA kommt es zur Rekrutierung der DNA Pol. Proteininteraktion mit Cdc45 und/oder RPA spielen eine wichtige Rolle. Es ist notwendig, dass eine Primase einen Primer herstellt (6-10nt lang) aus RNA (wird ausgeführt durch tetramere DNA-Pol. α- Primase-Komplex).

8. Schritt: (Replikationsgabel in Eukaryonten) Der hexamere MCM-Komplex entwickelt den leading strand und lasst Pol. ϵ mit GINS und Cdc45p am Strang entlangwandern. Am lagging strand ist die Pol. δ mit PCNA, RF-C, Fen1p und Dna2p mit der Pol. α-Primase und RPA gebunden an der single stranded DNA in der Schlinge.

9. Schritt: (Okazaki-Fragmentreifung) Während der Okazaki-Fragmentreifung wechseln sich Pol. δ und Fen1 in mehreren Zyklen ab, bis alle Initiator-RNA (iRNA) abgebaut ist. Es kommt zu einer Rekrutierung der DNA-Ligase, die den Strangbruch schließt. Danach dissoziieren
Pol. δ und Fen1 ab, es bleibt nur mehr die PCNA übrig.

BROCK

Ursprungserkennungskomplex: hexamerer Proteinkomplex; erkennt konservierte Sequenzen in Replikatoren (Hefe), die als A-Elemente bezeichnet werden, sowie eine zweite weniger konservierte Sequenz names B1-Element. Bindet und hydrolisiert ATP (wie DnaA). Die Assoziation mit ATP ist für die sequenzspezifische Bindung des ORC an die DNA erforderlich, während die ATP-Hydrolyse eine Voraussetzung für die Beteiligung des ORC am Laden der eukaryontischen DNA-Helicase auf die Replikatior-DNA darstellt.

Anders als bei DnaA führt die Bindung des ORC an Hefereplikatoren nicht zu einer Strangseperation in einem benachtbarten DNA-Abschnitt. Allerdings wird der ORC entweder direkt oder indirekt zur Rekrutierung der übrigen Replikationsproteine zu.....[read full text]

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Die Selektion eines Replikators erfolgt durch die Bildung eines so genannten Präreplikationskomplex (prä-PC). Der prä-RC besteht aus vier getrennten Proteinen, die in einer bestimmten Reihenfolge an jedem Repliaktor zusammengesetz werden. Der erste Schritt bei der Bildung des prä-RC ist die Erkennung des Replikators durch den eukaryotischen Initiator ORC. Nachdem der Ursprungserkennungskomplex ORC an den Replikator gebunden hat, dirigiert er zwei Helicase-Loader-Proteine namens CDC6 und CDT1 an diese Stelle.

Zusammen rekrutieren der ORC und die Helicase-Lader die eukaryotische Replikationsgabel-DNA-Helicase (MCM2-7-Komplex).

Der in der G1-Phase gebildete prä-RC erst zur Entwindung der DNA und zur Inititation der Replikation fähig, wenn die Zelle in die S-Phase des Zellzyklus eingetreten ist.
Die Aktivierung von Präreplikaionskomplexen (prä-RCs) zur Initiation der Repliaktion erfolgt durch die Aktivität von zwei Kinasen namens CDK (Cyclin-abhängige Kinase) und DDK (Dbf4-abhängige Kinase).

Protein-Kinasen sind Enzyme, die die Phosphorylierung ihrer Proteinsubstrate katalysieren. Die genannten Kinasen liegen in der G1-Phase in ihrer inaktiven Form vor und werden nur aktiviert, wenn die zelle in die S-Phase eintritt. Nach ihrer Aktivierung entfalten die Kinasen ihre Wirkung an den prä-RCs und anderen Replikationsproteinen. Die Phosphorylierung dieser Proteinsubstrate führt zur Assoziation vieler weiterer Replikationsproteine am Replikationsursprung und schließlich zur Initiation der Replikation.

Zur den neu herangezogenen Proteinen gehören z.B. die drei eukaryontischen DNA-Polymerasen und eineige andere Proteine, die rfür deren Rekrutierung erforderlich sind. (Rekrutierung nach der Reihenfolge: DNA-Pol δ, DNA-Pol ε und erst danach DNA-Pol α/PrimaseAnwesenheit alles Polymerasen vor der Synthese des ersten RNA-Primers sichergestellt, da diese durch die DNA-Pol α/Primase katalysiert wird.)
Nur einige der Proteine, die sich zur Initiation der Replikation am Ursprung versammelt haben, bilden im weiteren Verlauf der Replikation auch eine Komponente des eukaryontischen Replisoms.

Neben den drei eukaryontischen DNA-Polymerasen stellen auch der MCM-Komplex und viele weitere Faktoren, die für die Rekrutierung der DNA-Polymerasen erforderlich waren, anschließend einen Teil der Maschinerie an der .....

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Das ermöglicht der Pol. mit DNA jeder Sequenz zu funktionieren. Wenn ein Nucleotid bindet, rotieren die fingers um 60° zum palm und thumb um 8° zum palm. Die Veränderung wird aufgehoben, wenn das Nucleotid in die DNA eingebaut worden ist. Die DNA wird dann durch das Enzym weitergeschoben und stellt so eine leere Stelle bereit. Die Exonucleaseaktivität ist notwendig für das Entfernen von missgepaarten Basen.

Die DNA-Synthese ist ein metallkatalysierter Prozess: 3 Aspartat Seitenketten interagieren mit 2 Mg2+ Ionen, so dass die Struktur durch nicht passende Basen beeinträchtigt wird. Mg2+ essentiell für jede DNA-Pol.

Wie werden die Nucleosomen nach der Replikation assembliert?

Postreplikative Assemblierung von Nucleosomen (CAF1/PCNA): die alten Nucleosomen werden zufällig auf die Tochterstränge verteilt. Die neu synthetisierten Nucleosomen werdne durch CAF1 (Chromatin assembling factor) an die DNA gebracht. Nach der Replikation bleibt die PCNA und RFC an der DNA gebunden.
Die PCNA ist ortholog zu der sliding clamp in den Bakterien. Sie rekrutierut CAF1 und H3/H4 Tetramer an die DNA.

Die Faktoren RFC, PCNA, CAF1 dissoziieren ab und ein Dimer von H2A/H2B werden hinzugefügt.
Nach der Acetylierung von H4Lys5 werdne die H2A/H2B Dimere oben und unten angebracht. Anschließend erfolgt die Abspaltung des Acetylrestes.
Aufrechterhaltung des Chromatinstatus: der Einbau der Nucleosomen bewirkt die Aufrechterhaltung des Heterochromatinstatus. Wenn die Replikationsgabel über die DNA läuft, entstehen die beiden Tochterstränge.

Die alten Nucleosomen werden zufällig über die Stränge verteilt. Neue Nucleosomen, die von CAF1 hergestellt wurden, werdne auch zufällig über die Stränge verteilt.
Wenn Chromatin methyliert wird, dann binden an den methylierten Rest HP1 Proteine, welches eine HMT rekrutiert. Lys9 von H3 wird methyliert. Vorgang geht bis zum boundary element (dort sorgen HAT dafür, dass acetyliert wird, damit Mehtylierung nicht mehr möglich ist).


Probleme bei der Replikation l.....

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Fragen zu Kapitel 5- Rekombination


  1. Beschreiben Sie die homologe DNA Rekombination anhand des Beispiels von E. coli. Welche Proteine sind daran beteiligt? Was sind deren spezifische Aufgaben?

Das RecBCD System von E.Coli

RecB und RecC haben Helicasefunktion (können DNA Stränge auftrennen). RecBCD bindet an Doppelstrangbrüche, trennt sie auf und spaltet sie. Der Vorgang läuft solange, bis die Sequenz an chi Sequenz trifft. Wenn Rec an diese Sequenz trifft, wird RecB aktiver. Die 5`3`Exonucleaseaktivität wird dadurch verstärkt, die 3`5`Exonuclease verschwindet, ein 3`Übehang entsteht.

Es bleibt ein Einzelstrang über, der von RecA erkannt wird. RecA führt zum Einzelstrangaustausch. Sie bindet an die DNA in 5`3`, also an die einzelsträngige DNA. RuvA und RuvB bewirken branch migration. Dabei erfolgt die Wanderung der Holliday-Proteine durch RuvA und RuvB.
RuvA erkennt die Verbindung und bindet an holliday-junction. RuvB ist die treibende Kraft für die branch migration.

Er sorgt für die Schenkelwanderung. Er bildet ein Hexamer aus und ist eine ATPase (stellt die Energie zur Verfügung die die Wanderung ermöglicht).
RuvC löst die holliday-structure auf. Es kommt zum Schneiden und zur Ligation.
Voraussetzung für die homologe Rekombination ist die Homologie der Stränge. Sie müssen nicht ident sein, aber miteinander verwandt.

Zusatz:
Vorgang allgemein: Nach dem Doppelstrangbruch erfolgt der Abbau der DNA durch 5`3`Exonuclease, es erfolgt der Austausch der DNA-Stränge = Stranginvasion. Anschließend werden die Lücken gefüllt, danach erfolgt die Ligation. Die beiden Stränge sind kovalent miteinander verbunden. Anschließend erfolgt die branch migration (holliday structure) welche eine Heterod.....

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Transposition

Klassen von Transposons

  1. DNA-only-Transposons (können springen)

  • Is-Elemente – besitzen am Ende inverted repeads. Rekombinase bindet an IS-Element, macht versetzten Schnitt und damit einen Überhang. Durch Reparaturmechanismen kommt es zur Verdoppelung der Sequenz

  • Tn5 (Klasse 1 Transposons) zusammengesetzte Transposons; bestehen aus 2 IS-Elementen (nur einer der beiden ist aktiv); zusammengesetzte Transposons haben wichtige Bedeutung für Resistenzübertragung wenn ein Bakterim ein Tn5 aufnimmt, werden sie resistent gegen Bleomycin, Streptomycin, Kanamycin

  • Tn3 (Klasse 2 Transposons) komplexe Transposons; an den Randbereichen kürzere repeads und codiert für den Repressor der Transposase. Zusätzlich besitzt Tn3 eine res-site, wo ein Rekombinationsereignis erfolgt. Es beinhaltet keine IS-Elemente, sondern mehrere ORF.

Mechanismen:

  • Cut and paste – es kommt nicht zur Verdoppelung, sondern nur zu einer Verschiebung von einer Stellle auf die andere

  • Replikative Transposition – hier kommt es zur Verdoppelung der Kopie des Transposons, dann zum Rekombinationsereignis, vorher muss Cointegrat aufgelöst werden. An Resolvasestelle kommt es zum 2. Rekombinationsereignis.

  • Transposonmutagenese – komplexe Transposons springen auf diesem Weg; man führt Transposonm. ein und selektioniert .....

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Fragen zu Kapitel 6- DNA-Bindeproteine


  1. Ein Kollege aus Amerika schickt ihnen eine Probe mit DNA Bindeproteinen deren Wechselwirkungen Sie auf einem von Ihnen gefunden Promoter untersuchen sollen. Beschreiben Sie ihre Vorgehensweise um möglichst detaillierte Informationen über das Bindeverhalten der Proteine zu erhalten! Bedenken Sie auch die notwendigen Kontrollschritte!

Methoden zur Analyse der Bindungen an DNA

  1. EMSA
    Gibt eine limitierende Aussage darüber, wo ein Protein bindet, d.h. ob ein bestimmtes DNA-Stück von best. DNA-Bindeprotein erkannt wird. Man muss jedoch die Region vorher kennen, an dem eine mögliche Bindung stattfindet (bei EMSA nimmt man Promotorregion). Ein kurzes Fragment-DNA wird isoliert (100-200nt) und inkubiert mit dem DNA-Bindeprotein (muss schon im Vorhinein wissen wo es ca. bindet).

    Die DNA wandert schnell im elektrischen Feld, da sie negativ geladen ist. Wenn das Protein das Fragment erkennt, wird es binden und das Laufverhalten des Proteins wird verlangsamt, da der Komplex durch die Bindung größer wird. Der Komplex wandert also langsamer als die DNA. Dies geschieht unter nativen Bedingungen, d.h. es darf kein denaturierendes Polyacrylamidgel verwendet werden.
    Man muss dazu auch Kontrollen machen, insgesamt gibt es 4:
    1. 2 kurze Oligonucleotide werden verwendet.

    Eines dieser Nucleotide markiert man
    radioaktiv. Wenn man das DNA-Bindeprotein hinzugibt, erhält man einen Shift, d.h.
    eine Bande wird langsamer laufen (das Bindeprotein bindet mit gleicher WS an das
    radioaktiv und nicht radioaktiv markierte Oligonucleotid).
    2. In der Praxis verwendet man einen 100-200 fachen Überschuss an nicht radioaktiv
    markiertem Oligonucleotid.

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