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Biology

University, School

Johannes Kepler Universität Linz - JKU

Grade, Teacher, Year

2, Berger, 2016

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Text by Janine B. ©
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EINFÜHRUNG IN DIE MOLEKULARBIOLOG­IE Aufbau und Struktur der Nukleinsäuren, DNA: DNA ist ein Polymer aus Nukleotiden (Nukleosid mit angeesterter Phosphorsäure). Das C1 der Ribose ist N-glycosidisch mit einer Pyrimiden- bzw. Purinbase verbunden, am C2 der DNA fehlt der Sauerstoff, C3 bindet an Phosphat der vorhergehenden Nukleotids u. am C5 sitzt das Phosphat. Bei physiologischem pH ist das Phosphat-Backbo­ne vollständig deprotoniert. Bei dsDNA bilden Purinbasen mit Pyrimidenbasen H-Brücken aus. Meistens bilden ds Nukleinsäuren…
Physikalische Eigenschaften der Nukleinsäuren Die Fähigkeit der DNA-Einzelsträn­ge sich unter geeigneten Temperatur- und Ionenbedingunge­n wieder zu einem Doppelstrang zusammenzufügen nennt man Renaturierung oder Reassoziation. Die durch die Renaturierung gebildeten Moleküle heißen Hybridmoleküle und den Vorgang der Doppelstrangbil­dun­g Hybridisierung. Wenn sich Hybridmoleküle nicht ganz komplementär paaren kommt es zu Fehlpaarungen, den resultierenden Doppelstrang nennt man Heteroduplex. Dieser ist extrem…

Beide Enden haben ATP- und DNA-Bindemotive. Die coiled coil Struktur kommt durch die Heterodimerisierung zustande. Durch die Gelenksregion kommt es zu einer V-Förmigen Struktur, dadurch könne Cohesine Schwesterchromatiden zusammenhalten.
Condensine haben einen Kern mit einem Heterodimer aus SMC2 und SMC4.
Cohesine habne ein Heterodimer aus SMC1 und SMC3.
Condensin hat die Fähigkeit, positive Superspiralisierung in die DNA einzuführen, indem ATP hydrolisiert wird.
Die Separase schneidet Cohesine durch, damit Schwesterchromatiden gespalten werden.


Fragen zu Kapitel 4- DNA-Replikation

  1. Die Initiation der Replikation der Bakterien beschreiben. Welche Komponente sind beteiligt und deren Aufbau und die Regulation der Initiation! (erste 20 Nukleotide)

Benötigte Enzyme für die Initiation:

  • DnaB = Helicase

  • DnaC leitet DnaB an DNA

  • RNA Polymerase mit katalytischer UE DnaE

  • DnaA = Initiatorprotein, Erkennung der Bindestellen des Origins, dies sind Helix-turn-Helix DNA Bindeproteine mit Poly-A-Domäne

  • Gyrase

  • SSB

  • DnaC = Primase

  • DnaJ und Dank = Chaperones für Initiationskomplex

    Origin ist der Bereich, wo die Replikation beginnt. Replikon ist der Bereich, der von einem Origin aus repliziert wird.
    Die bakterien-DNA hat einen Origin und ein Replikon, d.h. es wird alles auf einmal repliziert.
    Die DnaA erkennt im ersten Schritt OriC (origin of replication bei E.coli). OriC von E.coli enthält 5 nonamere (je neun Basenpaare lange) Bindestellen für den Initiator DnaA sowie 3 tridecamere (je 13 Basepaare lange) Abschnitte, an denen die initiale Entwindung der DNA stattfindet.

    Der Minimal Origin ist 245 Bp lang. 9mere Consensussequenz für DnaA TTATNCANA.
    Man geht von 8-9 Bindestellen für DnaA aus. Die AT-reiche Regionen bilden sich aus 13-meren repeats aus.

    Die DnaA ist ein Helix-turn-Helix Bindeprotein und besitzt eine Poly-A-Domäne. In Gegenwart von ATP bildet es eine filamentöse Struktur aus um welche die DNA gewunden ist. Das Binden von ATP-DnaA an die DNA bewirkt das Aufschmelzen von DUE (DNA unwinding element). keine Helicase zum Aufschmelzen nötig. DnaA erkennt die Consensussequenz .....[read full text]

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  • Titration von DnaA an datA locus
    Im Bereich von datA gibt es sehr viele Bindestellen (8x so viele wie bei Origins), die durch Replikation noch mehr werden. Es kommt zu einer Verteilung der DnaA und somit zur geringeren Aufschmelzung der DNA.

  • ATP-Hydrolyse von ATP-DnaA zu ADP-DnaA
    (durch Hda und β-UE von Pol III (RIDA-Komplex)); Hda wird durch die β-UE der DNA-Pol III rekrutiert und triggert ATP Hydrolyse von ATP-DnaA.
    Hda führt dazu, dass ATP hydrolyiert, abfällt und nicht mehr neu initiiert werden kann.

  • DARS1 und DARS2 (DnaA Reactivating Sequenz)
    DNA bindet an DARS (Bindestellen), welche der DnaA helfen, dass es ADP gegen ATP austauscht.


    Zusatz:
    Replikationstermination in E.coli:

    Sequenzen, die die Replikation stoppen = ter-Elemente. Sie haben jeweils 23 Bp Consensussequenzen, welche eine Bindestelle für das Produkt der tus-Gene darstellt (=36kDa schweres Protein, ist um den Faktor 1000 stärker als DnaA. Die DNA-Helicase (DnaB) kann tus nicht verdrängen (von oben), auf anderen Seite schon; tus wirkt als Helicaseblocker).
    Tus bindet an die Consensussequenz, wo eine kontra-Helicaseaktivität bereitgestellt wird und die DnaB stoppt.
    Der leading Strang wird weiter synthetisiert bis zum ter-Element, während der lagging Strang ca. 50-100Bp vor ter initiiert ist.
    Durch diese Hemmung wird die Replikationsgabel aufgehalten und der Abbau des Replikationsapparates verursacht.

    Tus bindet asymmetrisch an die DNA, so dass tus in die eine Replikationsrichtung zwar funktioniert, in die andere Richtung einfach vom Replikationsapparat weggeschoben wird).


    Wiki und Brock
    Zunächst wird das Initiatorprotein DnaA durch ATP aktiviert und an fünf 9 bp lange DnaA-Boxen gebunden. Insgesamt lagern sich etwa 20 DnaA-Proteine als Schleife um die DNA zusammen. Die Proteine IHF und FIS binden an spezifische Abschnitte des oriC und lösen die Beugung der DNA zu einer haarnadelähnlichen Struktur aus, welche auch die Bindung von DnaA unterstützt.

    Schließlich kann die Entwindung der Doppelhelix an drei aufeinanderfolgenden, 13 bp langen Adenin- und Thymin-reichen Sequenzen (auch „13mer Sequenzen“ genannt) starten. . In diesem entwundenen DNA-Bereich steht somit ein ssDNA-Abschnitt als Matrize für den Start der RNA- und DNA-Syntheseschritte der Replikation durch weitere Replikation.....

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    Nach dem Voranschreiten der DNA-Helicase um etwa 1000 Basen wird auf jeder Folgestrangmatrize ein zweiter RNA-Primer synthetisiert und das resultierende Primer:Matrize-Hybrid wird in eine Sliding Clamp geladen. Die Primer:Matrize-Hybride werden durch die zweite DNA-Pol-III-Kernenzyme der beiden DNA-Pol-III-Holoenzyme erkannt und als Startpunkt für die Synthese eines Okazaki-Fragments des Folgestrang verwendet.

    Damit wurde die Leit- und Folgestrangsynthese an zwei Replikationsgabeln initiiert und werden im Folgenden bis zum Ende der Matrizenstänge oder bis zur Kollision mit einer anderen Repliaktionsgabel, die an einem benachbarten Replikationsursprung gestartet ist, fortgesetzt.

    1. Aufbau DNA Polymerase I und III. Welche Anwendung in der Praxis und welche Polymerasen gibt es noch und welche Vor- und Nachteile haben diese?

    Aufbau der DNA-Polymerase I

    Die DNA Polymerase I ist strukturell wie eine offene rechte Hand aufgebaut. Wenn man das Enzym reinigt und einer limitierenden Proteolyse unterwirft, erhält man das Klenow-Fragment (größeres Proteinfragment) und ein kleineres Proteinfragment. Die DNA-Pol.-Aktivität ist im Klenow-Fragment anzutreffen, es besitzt eine 5`-3`Polymeraseaktiviät und die 3`-5`-Exonucleaseaktivität, welche eine proof-reading Aktivität hat (entfernt falsch eingebaute Nucleotide).

    Im kleinen Fragment findet man die 5`-3`Exonucleaseaktivität (Primer und Nucleotide können dadurch abgebaut werden, genutzt um alte Okazakifragmente abzubauen).
    Aufbau der DNA-Polymerase III (hohe Prozessivität)

    Sie macht die eigentliche Replikation, welche im α-Teil in der (theta) θ-und ϵ-UE stattfindet (=katalytische Core).
    ϵ ist die 3`-5`Exonuclease. Die Funktion der θ-UE ist nicht gut verstanden, sie dient aber vermutlich der Stabilität und der Verbesserung der ϵ-UE.
    2 α-UE sind jeweils mit einer ϵ-UE und einer θ-UE über τ -UE verbunden. Pro α-UE hat man 2 β-UE, die als sliding clamp fungieren.

    Sie hält das Enzym an der DNA (Prozessivitätsfaktor der Pol III), verhindert dass das katalytische core herunterfällt und bindet nur dort, wo sie gebraucht wird (Grund: durch scharfen Knick – DNA muss durch γ-UE hindurch – kann nur einzelsträngige DNA hindurch, sliding clamp bindet am Übergang von Primer zu single strand).
    Der γ-Komplex (UE) ist dafür verantwortlich, dass die slid.....

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  • primer extension
    Wird zur Bestimmung des 5`Endes (Transkriptionsstartpunkt) von einzelsträngiger DNA verwendet. Der Primer sollte ca. 20 nt lang sein. Dann kommt das Klenow-Fragment hinzu. Hier erhält man ein spezifisches Produkt (radioaktiv markierte Nucleotidkette), welches benötigt wird, um das 5`Ende der DNA zu bestimmen. Das gleiche kann man auch mit RNA machen, statt dem Klenow-Fragment wird reverse Transkriptase verwendet.
    Dabei wird der Transkriptionsstartpunkt der mRNA bestimmt.

    Dann entwirft man einen Primer, nicht zu weit entfernt vom vermuteten Startpunkt, und arbeitet mit der reversen Transkriptase. Wird auch verwendet um Promotoren zu finden.

  • Auffüllen von Enden für Klonierung
    Manchmal hat man nicht alle Restriktionsschnittstellen zur Verfügung, dann braucht man eine bam (= Restriktionsenzyme, welche sticky ends fabrizieren). Man benötigt das Klenow-Fragment um aus sticky ends blunt ends zu machen. Man generiert auf die Ziel-DNA blunt ends, da im Zielorganismus möglicherweise die falschen Restriktionsenzyme vorhanden sind.

  • Der 3`Überhang wird gekappt und der 5`Überhang wird mit Klenow-Fragment verlängert (beim 3`Überhang kanbbert das Klenow-Enzym jedes Nucleotid einzeln ab, beim 5`Überhang verlängert das Klenow-Enzym).

    1. Polymerase III
      spielt in SOS-response-Reparatur eine Rolle

    2. Andere Polymerasen

    • T4 DNA Polymerase
      bei blunt end-Herstellung, durch 3`5`Exonucleaseaktivität; Vorteil: Aktivität höher als die des Klenow-Fragments; verdrängt donwstream Oligonucleotide im Zuge der Polymerisation nicht. Wird speziell für Klonierungen verwendet.

    • T7 DNA Polymerase
      modifizierte Form ohne 3`5`Exonucleaseaktivität; Vorteil: hat hohe Prozessivität, daher speziell für Sanger Sequenzierung

    1. Thermostabile Polymerasen für die PCR

    • taq
      Vorteil: günstig
      Nachteil: hat eine hohe Fehlerrate, da es keine proofreading-Aktivität hat, daher auch nicht für Klonierung geeignet

    • pfu
      Vorteil: geringe Fehlerrate
      Nachteil: teuer; für Klonierungsarbeiten verwendet, da geringe Fehlerrate durch Proofreading-Aktivität.

    • Vent
      Vorteil: lange HWZ
      Nachteil: langsam

    • Phusion
      Vorteil: höhere Prozessivität, viel schneller
      Nachteil: .....

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  • PCNA: die sliding clamp besteht aus PCNA. Sie ist strukturell verwandt zur β-UE von Pol III. In Eukaryonten ist sie ein Trimer (in Bakterien ein Dimer). Sie ist ein Prozessivitätsfaktor und assembliert die δ Polymerase. Man weiß nicht, ob es auch eine ϵ Polymerase assembliert. Die Prozessivität von δ Pol ist somit stark erhöht.

  • Replikationsfaktor A: ist ein single strand binding protein (SSB)

  • Replikationsfaktor C: Elongation

  • Exonucleasen: 3`-5`Exonuclease δ-ϵ; 5`3`-Exonucleasen haben Eukaryonten nicht, sie brachen z.B. MF1 (entfernt RNA-Primer), FAN 1

  • Topoisomerase I,II und DNA Ligase


    (Zusatz:)

    Origins in Eukaryonten

    Die Origins sind unterschiedlich – knospende Hefe: ARS (130 Bp), sich teilende Hefe: ARS (450 Bp), Säugetiere: B2 Origin, ORC binding site (78 Bp), Ursprung heißt OBR (origin of bidirectional replication) woran ORC bindet.
    Zusätzlich gibt es B1, B2 und B3. Jeder Origin hat eine B1 Region, vielen fehlt jedoch die B3 Region. An B3 bindet der Transkriptionsfaktor, B2 zum Aufschmelzen.

    ORC Komplex bindet an ARS Element (ORC aus 6 ORC Proteinen und konserviert)
    DUE (DNA unwinding element), ORC (origin recognition complex), OBR (origin of bidirectional replication).

    Origins in Säugern

    Die meisten Origins überlappen mit transkriptionell regulierten Elementen, was eine Rolle bie der regulierten Origin Auswahl spielt. Das könnte durch direkte oder indirekte Rekrutierung von UE des pre-replicative-complex durch Transkriptionsfaktoren erreicht werden.
    Der AP-1 Komplex ist mit 20% der bekannten Origins in Human zellen assoziiert. Es€ wird vermutet, dass er in der Origin-Auswahl involviert ist.

    AP-1 rekrutiert speziell die Histonacetyltransferase (HBO 1). Dieser Faktor ist zuständig für die Kontrolle der Origingenehmeigung in Absprache mit AP-1 in der Rolle de.....

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    Die Bindung mit Cyclin A ist notwendig, um weiter durch die S-Phase voranzuschreiten.
    Die Aktivität wird auch durch Phosphorylierung reguliert. Ist die Thr160 Gruppe phosphoryliert, ist die Cdk2 aktiv. Kommt es jedoch durch den Cki (cycline kinase inhibitor) zu einer Dephosphorylierung der Thr160 und einer Phosphorylierung der Thr14 und Tyr15, wird Cdk inaktiviert.

    Durch das Cdc25A kommt es zu einer Umesterung und Abspaltung der Phosphatreste, damit Cdk2 wieder aktiv wird.
    Checkpointaktivierung z.B. bei UV-Bestrahlung
    Wenn die Zelle merkt, dass DNA-Schäden vorhanden sind, z.B. wenn einzelsträngige DNA auftaucht, werden die Proteinkinasen ATM und ATR aktiviert. Diese phosphorylieren die Checkpointkinasen, die wiederum die Phosphorylierung verschiedener Substrate der Zelle, z.B. p53 bewirken. p53 ist ein Tumorrepressorgen, wenn es phosphoryliert wird, wird es nicht so schnell abgebaut (durch Mdm2) und akkumuliert in der Zelle (häuft sich in der Zelle an). p53 ist ein Transkriptionsaktivator der bewirkt, dass p21 (ein Cdk-Inhibitor) verstärkt gebildet wird. p21 bindet wiederum an Cdk2/Cyc.E, was zur Inaktivierung des Komplexes führt.
    Neben dem langen Weg gibt es auch den sofortigen response, der zur Phosphorylierung und anschließender Ubiquitinierung von Cdc24 führt.

    Ohne der Aktivierung der Checkpoints schreitet der Zellzyklus voran (wie schon erwähnt, ist Cdc25A ist eine Proteinphosphatase, die Threonin14 und Tyrosin15 dephosphoryliert und dadurch Cdk2/Cyc.E in aktiver Form haltet. Durch Checkpointkinasen wird die Cdc25A phosphoryliert, ubiquitiniert und abgebaut. Cdk2/Cyc.E bleibt aktiv und geht in die S-Phase.
    Die Komplexe werden schließlich aufgelöst und die Chromatiden, die zunächst durch Cohäsine zusammengehalten wurden, liegen gestreckt vor).
    Aktivierung von Cdk2/Cyc.E: Die Aktivierung des Cdk2/Cyc.E-Komplexes erfolgt beim Übergang von G1 in die S-Phase durch Mitogene (=Wachstumsfaktoren).

    Durch Binden der Mitogene an die Rezeptoren der Cytoplasmamembran wird Cdk4 und Cdk6 aktiviert, die wiederum die Phosphorylierung von Retinoplastomaprotein pRb und p130 bewirken. CycD phosphoryliert Retinoplastomaproteine, wodurch die Bindung von E2F nicht mehr möglich ist (bei Binden an E2F wird die Transkription von EF2 verhindert). Dadurch wird Cyclin E * verstärkt transkribiert und es wird verstärkt noch mehr Retinoplastomaprotein aktiviert und noch mehr Cdk2/Cyc.E gebildet.
    Das Retinoplastomaprotein ist ein Tumorrepressor und kann bei Mutation zur Tumorerkrankung der Retina führen.

    Beide Proteine (pRb, p130) liegen normalerweise mit E2F im Komplex vor. Allerdings können sie nur in unphosphorylierter Form an E2F binden. Bei Phosphorylierung wird die Transkription von E2F vorangetrieben.

    *
    - Cyclin E bewirkt wiederum eine verstärkte Phosphorylierung des Retionplstomaproteins
    und von p130, wodurch dieses noch weniger aktiv ist.
    - Weiteres führt Cyclin E noch zur Phosphorylierung weiterer Komponenten, die an den
    Origin gebunden sind. Außerdem führt Cyclin E noch zur Phosphorylierung von Cdk
    Inhibitor p27, der durch die Phosporylierung ubiquitiniert und abgebaut wird.

    Dies
    geschieht, damit Cdk2/Cyc.E aktiv bleiben und noch mehr Cyclin E aktiviert wird.
    - eine weitere Aufgabe von Cyclin E besteht darin, NAPT zu phsphorylieren, der für die
    Histonbiosynthese nötig ist. Cdk2/Cyc.E stimuliert die DNA-Synthese durch das Cdc45
    abhängige Laden der Polymerase α.
    Cyclin E hat auch Einfluss auf die Histonbiosynthese.
    Myc ist ein Transkriptionsaktivator und ist identifiziert worden als eins der Onkogene.
    Es führt also durch Überexpremierung zu Krebs und zur verstärk.....

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