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Prüfungsvorbereitung
Biowissenschaften

Johannes Kepler Universität Linz - JKU

2, Berger, 2016

Kerstin A. ©
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ID# 68670







Fragen zu Kapitel 1- Aufbau und Struktur der Nukleinsäuren


  1. Einteilung der Sequenzen im Genom und Lebenszyklus von L1-Element (da meinte er Hochrepetitive und Mittelrepetive Sequenzen bzw. Nonretroviral Retrotransposon L1-RNA und Einbau mittels Reverser Transkriptase)

Sequenzen im Genom

a) Hochrepititive DNA

  • Satelliten (im Centromerbereich; >100kb)

  • Minisatelliten (im Telomerbereich; 0,1-20kb)

  • Microsatelliten (verteilt im ganzen Genom, meist im nichtcodierenden Bereich ; <150kb)

b) MIttelrepitive DNA

  • Pseudogene (=Gene die durch Duplikation entstehen, im Laufe der Evolution brauchte man nur 1 Gen, das zweite verursacht nur Mutationen, d.h. es ist nicht funktionell, ist aber trotzdem im Genom. Wenn DNA renaturiert, kann es sein, dass es sich mit Pseudogen verbindet – Retrotransposition, und Aufnahme einer Unfähigkeit; sind unfähig, Proteine zu codieren)

  • rRNA-repeads (45 SrRNA – prozessiert zu 18S, 5,8S, 28SrRNA  ergeben 80SrRNA +

5SrRNA; es entsteht nicht maturierte 40S (aus 18SrRNA + 33Proteinen) und 60S (aus 28S, 5,8S, 5SrRNA + 50 Proteine), wenn aus Zellkern transportiert sind sie 40S und 60S Untereinheiten und bilden das Ribosom)

  • Interspersedrepeads

  • Retrotransposons (LINE (L1), SINE (Alu) (100-300 Bp lang) – keine inverted repeads, brauchen ORF um springen zu können)

  • LTR (long terminal repeads) (HERV, humane endogene retroviren; codieren für reverse Transkriptase, die Transposition passiert über RNA-Zwischenstufen, Unterschied zwischen Retroviren und Retrotransposons: Retrotransposons können Zelle nicht verlassen)

  • DNA-Transposons

Lebenszyklus von L1-Element:

Ein typisches LINE-Element im Säugerdarm ist das L1. Es ist das einzige Element aus der LINE-Familie, das im humanen Genom noch aktiv ist. Line-Elemente haben auch reverse Transkriptaseaktivität, aber dafür benötigen sie LTRs und benutzen einen anderen Mechanismus von Retroviren, um die reverse Transkriptasereaktion zu primen. LINE-Elemente in Säugetieren haben 2 Leserahmen: ORF1, das für ein nucleinsäurebindendes Protein codiert und ORF2, das für reverse Transkriptase- und Endonucleaseaktivität codiert.
Das L1-Element beginnt mit einer ca. 900 Bp langen 5`UTR (untranslatierten Region), der den Promotor des Elements enthält.

Darauf folgen ORF1 und ORF2. Das L1 Element wird transkribiert und dann beide ORFs.
Die L1-Elemente im Chromosom werden transkribiert und polyadenyliert. Es entsteht die L1-RNA. Während sie transkribiert werden, werden sie ins Cytoplasma transportiert, wo sie translatiert werden. L1 besitzt zwei ORFs.
Die Endonuclease/reverse Transkriptase wird translatiert. Die Erkennungssequenz beinhaltet AAA Reste, welche am komplementären Strang TTT Reste beinhalten.

Diese Paaren sich mit Poly-A-Resten an der L1 RNA.
Sobald die Endonuclease/reverse Transkriptase translatiert ist, erfolgt der Transport in den Kern, wo der Schnitt des 1. Stranges der target DNA erfolgt. Er wird verdrängt und bildet mit der mRNA komplementäre Basen aus. Der 1. Strang ist also komplementär zur mRNA. Das 3`OH Ende wird als Primer verwendet, um die cDNA herzustellen.

Wenn der 1. Strang erstellt ist, wird der 2. über einen mehrstufigen Prozess hinzusynthetisiert. Dadurch entsteht eine neue Kopie des L1 an irgendeiner Position im Genom. Wenn der 2. Strang hinzusynthetisiert wird, können leicht Fehler passieren, deshalb findet man oft verkürzte L1 Elemente im Genom. Die reverse Transkriptase von L1 ist vermutlich auch verantwortlich für die Bildung von prozessierten Pseudogenen, die irgendwo integriert werden.


  1. Micro-Arrays

DNA-Microarrays dienen dazu, um das Genexpressionsverhalten zweier beliebiger Proben miteinander zu vergleichen, z.B. um die mRNA-Profile normaler Zellen mit den von Tumorzellen zu vergleichen. Es gibt zwei verschiedene Arten von DNA-Microarrays:

  • Spotted Microarrays - bei denen cDNA, Oligonucleotide oder Fragmente von PCR Produkten auf das entsprechende Träge.....

  • Bakterien haben keine5`Cap-Struktur, sie tragen am 5`Nucleotid ein Triphosphat

  • Sie haben keineIntrons (niedrige Eukaryonten, z.B. Hefe hat nur 200 Introns

    mRNA von Eukaryonten

    • Monocistronisch

    • Bei Eukaryonten wird das erste Nucleotid durch die 5`Cap-Struktur geschützt (cap capping enzyme, welches eine 5`5`Bindung zwischen dem ersten Nucleotid und einem Guanosin bildet). Diese 5`Cap-Struktur ist extrem wichtig für die Stabilität. Ohne die 5`Cap-Struktur würde die mRNA sofort abgebaut werden.

    • In Eukaryonten ist eine GMP (Guanosylmonophosphat) in der eine Methylierung eingebaut ist, vorhanden. Diese ist wichtig für die Erkennung der Translationsfaktoren in Eukaryonten.

    • Die mRNA der Eukaryonten trägt eine Poly-A-Schwanz am 3`Ende

    • Eukaryontische mRNA beinhaltet Introns (dafür kurze Exons)

    1. Faktoren, die die Schmelztemperatur der DNA beeinflussen? (in welche Richtung) Die Auswirkungen beschreiben.

    siehe Frage 3


    1. Southern Blot – beschreiben und wozu wird dieser verwendet?

    Die Hybridisierungstechnik dient zum Nachweis der strukturellen Verwandtschaft von Nucleinsäuren und zur Isolierung spezifischer Nucleinsäuresequenzen, d.h. um gezielt best. Fragmente nachzuweisen (um z.B. herauszufinden, ob ein best. Gen im Organismus vorhanden ist).
    Prozess: Die geschnittene DNA (durch Restriktionsendonucleasen) wird elektrophoretisch mittels Gelelektrophorese nach ihrer Größe nach aufgetrennt.

  • Das Gel (Agarosegel) wird anschließend in eine starke Lauge gelegt um die doppelsträngigen DNA-Moleküle zu denaturieren (=alkalische Denaturierung).
    Dann überträgt (blottet) man die jetzt einzelsträngigen Fragmente auf ein Nitrocellulosepapier, auf dem ein molekularer Abdruck der Bandenverteilung des Gels (Blot) entsteht.
    Nachdem die zu untersuchende DNA an die Membran gebunden ist, wird die Membran mit einem Gemischunspezifischer DNA-Fragmente inkubiert und alle freien Bindungsstellen auf der Membran werden abgesättigt.
    Die auf der Membran gebundene DNA wird mit einer Lösung behandelt, die radioaktiv markierte DNA Sonde enthält.

    Da alle unspezifischen Bindungsstellen zuvor abgesättigt wurden, kann die Sonden-DNA nur an eine komplementäre, einzelsträngige DNA im Bandenmuster des Gels binden. Dieser Hybridisierungsschritt wird daher unter Bedingungen durchgeführt, die nahe am Denaturierungs-/Renaturierungspunkt der Nucleinsäuren liegen.
    Durch Waschen werden unspezifische Bindungen an der DNA-Sonde weggewaschen, die gebundenen Sonden bleiben hybridisiert.
    Legt man einen Röntgenfilm auf und entwickelt diesen dann, entsteht ein Autoradiogramm, wenn eine radioaktive Sonde verwendet wurde.

    Die Schwärzung des Films zeigt die Position der Hybridbanden auf dem Blot. Dort wo radioaktive Sonde gebunden ist, dort befindet sich das spezifische Gen.

    1. Repetitive Sequenzen (Welche gibt es? Wo kommen sie vor? Prozentueller Anteil? .....

    Die DNA kann auch verschiedene Helixtypen ausbilden: A, B, Z.
    Auch die Sequenz hat einen Einfluss auf die Struktur der DNA: 5 Adenin hintereinander bewirken eine 20° Biegung, was zu einem verändertenLaufverhalten in der Gelelektrophorese und einem veränderten Einbau von Ethidiumbromid führt.
    Die N-glycosidischenBindungen der Basenpaare stehen sich nicht genau gegenüber, dadurch kommt es zur großen und kleinenFurche.

    DNA-Bindeproteine

    • Helix-turn-Helix – helix-loop-helix, kommen hauptsächlich in Prokaryonten vor aber auch in Eukaryonten. Sie binden als Dimer, haben Balindromische Erkennungssequenzen, werden in große Furche gedrückt, Erkennung erfolgt über die H-Brücken-WW.

    • Zink-koordinierte Protein – Hormonrezeptoren, β β α -Zinkfinger, Zink mittels His und Cys gebunden), in Eukaryonten vorkommend.
      Für eine bessere Spezifität sind mehrere Zinkfinger hintereinandergeschaltet, ein Zinkion dient der Stabilität.

    • Zipperhältige Proteine – Leucin-Zipper, z.B. TF, AP1. Erkennung in der großen Furche durch basische Reste am N-Terminus.

    • Andere α-Helixes

  • β-sheet / β-Faltblatt – z.B. TBP; kommt in Eukaryonten und Prokaryonten vor. Sie binden in die kleine Furche (dort sitzen zusätzliche Faktoren, die die Funktion der TATA-Box beeinflussen); Phenylalaninsreste werden in die DNA eingeschoben, daher wird die DNA stark gekrümmt (sattelförmige Struktur)

  • β-Hairpins- binden über antiparallele β-sheets in die kleine Furche

  • Restriktionsenzyme (Enzyme)


    DNA Bindeproteine haben Auswirkung auf die Struktur des Chromatins, wodurch die Assemblierung der Transkriptionsmaschinerie beeinflusst wird.
    SpezifischeDNA Bindeproteine: Transkriptionsfaktoren, DNA-repair-proteins, Repressorproteine. Unspezifische DNA Bindeproteine: Polymerasen, Helicasen, Primasen, Topoisomerasen, Histone (Nucleosom)

    Methoden zur Analyse der Bindungen an DNA

    1. EMSA (electrophoretic mobility shift assay) -> Promotorregionen
      Gibt eine limitierende Aussage darüber, wo ein Protein bindet, d.h. ob ein bestimmtes DNA-Stück von best. DNA-Bindeprotein erkannt wird. Man muss jedoch die Region vorher kennen, an dem eine mögliche Bindung stattfindet (bei EMSA nimmt man Promotorregion). Ein kurzes Fragment-DNA wird isoliert (100-200nt) und inkubiert mit dem DNA-Bindeprotein (muss schon im Vorhinein wissen wo es ca. bindet).

      Die DNA wandert schnell im elektrischen Feld, da sie negativ geladen ist. Wenn das Protein das Fragment erkennt, wird es binden und das Laufverhalten des Proteins wird verlangsamt, da der Komplex durch die Bindung größer wird. Der Komplex wandert also langsamer als die DNA. Dies geschieht unter nativen Bedingungen, d.h. es darf keindenaturierendesPolyacrylamidgel verwendet werden.
      Man muss dazu auch Kontrollen machen, insgesamt gibt es 4:
      1. 2 kurze Oligonucleotide werden ver.....

  • Weitere wären: Filterbindung, Westernblot, Protein-DNA-cross-linking, screening einer Expressionsbibliothek mit DNA-Sonde


    1. Methoden für die Sequenzierung der DNA aufzählen und die Methoden in den Grundzügen erklären. / Wie kann man eine DNA-Sequenz bestimmen? Nenne mind. vier Sequenzierungstechniken und beschreibe diese.

    Bestimmung der DNA-Sequenz

    1. Chemische Sequenzierung
      Zunächst wird die DNA radioaktiv markiert (Phosphor 32). Dann werden die Basen modifiziert, z.B. mit Hydrazin und durch Alkalibehandlung mit Piperidin an modifizierter Stelle gespalten (4 getrennte Ansätze). Man erhält Fragmente unterschiedlicher Länge, diese werden auf einem DNA-Agarosegel aufgetrennt mittels Gelelektrophorese. Durch Vergleich der 4 Ansätze auf dem Gel lässt sich die Sequenz ablesen.
      Diese Methode wurde z.B. zur Bestimmung der Operonsequenz eines Bakteriengenoms verwendet, ist aber heute aus der Mode gekommen, da man mit gefährlichen Reagenzien arbeitet und die Methode schwer automatisierbar ist.

      Außerdem wurde sie von der Sanger-Methode abgelöst.

    Sanger Sequenzierung
    (Kettenabbruchmethode mit ddNTP Primer und DNA-Pol)
    Man hat 4 verschiedene Ansätze. Jeder enthält ein spezifisches ddNTP (didesoxynucleotid) im Unterschuss und ein radioaktives Nucleotid. Der Einbau eines ddNTPs führt zum Abbruch der Polymerisationsreaktion (da kein OH zum Anhängen von Nucleotide vorhanden ist).
    Ausgehend von einem Primer wird durch eine DNA-Polymerase einer der beiden komplementären DNA-Stränge verlängert.

    Zunächst wird die DNA denaturiert. In 4 sonst gleichen Ansätzen wird je einer der 4 Basen zum Teil alsddNTP zugegeben.
    Diese Kettenabbruch-ddNTPs besitzen keine 3`OH Gruppe, daher ist beim Einbau eine Verlängerung der DNA nicht mehr möglich, da die OH-Gruppe zum Verknüpfen fehlt.
    Es entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die in jedem Ansatz mit dem .....

    Die winzige Größe der Vertiefungen stellt sicher, dass nicht mehr als ein Kügelchen hineinpasst. Die so verankerten DNA-Moleküle werden einer Polymerasekettenreaktion unterworfen, um die Molekülzahl zu vergrößern. Da jede Kugel nur eine DNA trägt, wird nur diese vervielfältigt und es entsteht in jeder Vertiefung eine homogene Population von DNA-Molekülen. Diese dienen dann als Matrizen für eine weitere Syntheserunde, bei der neben der DNA-Polymerase auch biolumineszenteProteine hinzugefügt werden.

    Diese neuerliche DNA-Synthese wird allerdings schrittweise durchgeführt, wobei die Platte nacheinander jeweils mit dATP, dGTP, dCTP und schließlich dTTP inkubiert wird. Zwischendurch wird gewaschen. Der Einbau des jeweiligen Desoxyribonucleotids erfolgt nur, wenn das komplementäre Nucleotid auf dem Matrizenstrang vorliegt. Dabei wird Pyrophosphat freigesetzt, das über gekoppelte enzymatische Reaktionen zur Freisetzung von Lichtsignalen führt, die von einem lichtempfindlichen Mikroprozessor erfasst und an einen Computer weitergeleitet werden.

    Die Lichtsignale zeigen an, welcher Nucleotidtyp in welcher Vertiefung eingebaut wurde. So lassen sich die Sequenzen der DNA-Moleküle in allen Vertiefungen gleichzeitigermitteln. Die sequenzielle Zugabe der Nucleotide kann 200-250 Basen lang fortgesetzt werden.

    Der Vorgang muss mehrmals wiederholt werden, um Fehler auszuschließen und um festzustellen, ob alle Gene erfasst worden sind.


    1. Solid-Sequenzierung durch Ligation
      Wie bei Roche-Sequenzierung werden die Moleküle zunächst einzeln in beads gekoppelt und in einer Wasser-Öl-Emulsion klonal vermehrt. Die beads werden auf einen soliden Träger gebracht. Dann wird ein Gemisch aus farbmarkierter octamer-Nucleodtide, fluoreszierende kurze Primer mit unterschiedlichen Sequenzen, zugegeben. Die ersten 2 Nucleotide sind für die Ligation von Bedeutung. Nach dem 5. Nucleotid wird abgespalten.
      Nach mehreren Zyklen kann so die DNA-Sequenz bestimmt werden.

      Die Oligonucleotide „tasten“ den unbekannten DNA-Strang ab. Passt ein Oligonucleotid, so wird es durch Ligation gebunden. Seine Fluoreszenzfarbe zeigt die Sequenz des gebundenen Moleküls an. Im nächsten Zyklus wird die Fluoreszenz entfernt und ein neues Oligonucleotid gebunden.


    1. Solexa/Illumina
      Das Grundprinzip ist der 454-Sequenzierung ähnlich. Der Unterschied besteht darin, dass die DNA-Moleküle direkt an einen Glasträger (ohne Vertiefungen) gebunden werden. Dabei werden mit einer moderaten Amplifikation per PCR etwa 100 Kopien einer einzelnen DNA-Sequenz an einem bestimmten Punkt des Glasträgers erzeugt. In einem modifizierten Kettenabbruchverfahren werden vier verschiedene Fluoreszensfarbstoffe für die vier Basenpaare verwendet.

      Bei diesem Ansatz gibt es jedoch zwei wesentliche Einschränkungen, die die Sequenzierung auf Längen von etwa 30-50 Basen beschränken. Erstens sind die DNA-Proben auf dem Träger nicht geordnet. Dies erschwert die Detektion und Zuordnung der Lichtsignale. Zweitens enthalten die Probenkammern mit den Kügelchen bei der 454-Sequenzierung eine etwa 10x höhere Menge an DNA als bei Solexa/I.....

    Dieser Vorgang verbraucht ATP. Topoisomerase I verbraucht keine Energie und entfernt das Supercoil, indem sie nur einen Strang schneidet, sich um den geschlossenen Strang dreht und die Lücke wieder verschließt. So kann die RNA- und DNA-Synthese nur ablaufen, wenn ausreichend ATP vorhanden ist. Unter Hungerbedingungen findet keine Synthese statt.
    Arten von Topoismomerasen
    (=Enzyme, die die DNA-Topologie verändern.

    Sie sind wichtig um topologische Spannungen bei der Transkription und Replikation zu verhindern, bevor positive Supercoils die Bewegung der Enzyme stoppen.)

    1. Topoisomerase I
      Bei Bakterien kommt die Topoisomerase IA vor. Sie entspannt negativ superspiralisierte DNA (bindet an 5`Phosphat) um eine linking number von 1.
      Bei Eukaryonten kommt die Topoisomerase IB vor. Sie entspannt positive und negative Superspiralisierung (bindet am 3`Phosphat) um eine linking number von 1.
      Das Prinzip der Topisomerase I: Es wird ein Strang gebrochen und die Enden gesichert, indem sie kovalent an Tyrosin (Tyr)-Rest binden.

    Der intakte Strang wird durch eine Fuge geführt und der Bruch wird wieder geschlossen. Die Topoisomerase I kann relaxieren, knotting/unknotting machen, Duplex bilden oder wenn der Nick schon vorhanden ist, ein Catenan bilden oder auflösen.


    Reaktionsmechanismus der Topoisomerase IA:
    Zu Beginn bindet die Topoisomerase an einen Abschnitt der doppelsträgigen DNA, in dem die beiden Stränge aufgeschmolzen daliegen. Einer der Stränge wird in eine Spalte des Enzyms gebunden, in der er nahe am Tyr-Rest im aktiven Zentrum positioniert wird. Dieser Strang wird dann gespalten, wodurch neben dem Strangbruch das kovalente Topoisomerase I DNA Zwischenprodukt entsteht.  Einzelstrangbruch und Erzeugung einer großen Stranglücke:
    Tyr bindet kovalent an DNA.

    Der Einzelstrang wird geschnitten. Der 1. Strang ist gebunden an den Tyr-Rest und der 2.Strang ist nicht kovalent gebunden an das Enzym.
    Das nicht kovalent in das Enzym gebundene Strangende muss fest mit der Topoisomerase assoziiert bleiben. Im Anschluss an die Strangspaltung unterliegt die Topoisomerase einer Konformationsänderung bei der eine breite Lücke zwischen den beiden Strangenden geöffnet wird.

    Diese Lücke wird vom Enzymmolekül überbrückt.
    Der 2. (intakte) Strang wird durch die Lücke durchgeführt und an einer DNA-bindenden Stelle in einem innenliegendem, dounatförmigen Loch im Protein gebunden. Danach werden die beiden Strangenden des gespaltenen DNA-Stranges wieder einander angenähert.
    Anschließend erfolgt die kovalente Wiederverknüpfung der beiden Strangenden durch eine Umesterung (diese Umesterung braucht kein ATP, ist aber nur bei Topoisomerase I so, bei Topoisomerase II wird ATP benötigt!).
    Nach der Verknüpfung der DNA-Enden muss sich das Enzym ein weiteres Mal öffnen, um die DNA .....


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