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Laborbericht

Enzym­ki­ne­tik: Isolie­rung und Charak­te­ri­sie­rung von Urease

1.733 Wörter / ~16 Seiten sternsternsternsternstern Autorin Elisabeth W. im Dez. 2018
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Laborbericht
Biowissenschaften

Universität, Schule

Ruhr-Universität Bochum - RUB

Note, Lehrer, Jahr

testiert, 2018

Autor / Copyright
Elisabeth W. ©
Metadaten
Preis 5.30
Format: pdf
Größe: 0.36 Mb
Ohne Kopierschutz
Bewertung
sternsternsternsternstern
ID# 78929







Biochemische Arbeitstechniken


Versuch BA-5

Enzymkinetik Urease


22.11.2018


Einleitung

Die Urease (Harnstoff-Amidohydrolase) ist ein Enzym das als Desaminase die Hydrolyse von Harnstoff katalysiert. Harnstoff zerfällt dabei zu Ammoniak und Carbaminsäure, die im weiteren Verlauf zu Kohlensäure und einem weiteren Ammoniak Molekül zerfällt.

Abb 1 Urease Reaktion1

Ureasen sind beteiligt am Stickstoffstoffwechsel im menschlichen Organismis und kommen außerdem in Bakterien, Pilzen, sowie in höheren Pflanzen vor.

Das aktive Zentrum der Urease besteht aus zwei Nickelionen. Sie werden über carbamylierte Seitenketten eines Lysinrestes und über ein Wassermolekül verbrückt. Bei der Hydrolyse Reaktion kann der Harnstoff als Substrat dann an einen der beiden Nickelionen koordinieren.

Die Aktivität der Urease hängt von Anwesenheit inaktiver Cystein-SH-Gruppen ab. Finden Oxidationsprozesse statt, so kommt es zu einer reversieblen Inaktivierung des Enzyms durch Bildung von Disulfidbrücken. Durch Spaltung der Disulfidbrücken mit Sulfhydryl-Reagenzien (R-SH) wie Glutathion oder Cystein kann das Enzym wieder reaktiviert werden.

Zur Verhinderung der Inaktivierung kann Dithiothreitol (DTT) hinzugefügt werden, welches anstelle der Cystein-SH-Gruppe oxidiert wird. Außerdem kann EDTA hinzugegeben werden, um eine Beschleunigung von Oxidationsprozessen durch zweiwertige Schwermetallkationen zu verhindern, in dem es Schwermetallspuren komplexiert.

Im folgenden Versuch soll die Enzymaktivität von Urease bestimmt werden. Dazu wird der gekoppete optische Test mit Glutamatdehydrogenase (GLDH) durchgeführt. Hierzu wird neben der Urease Reaktion die enzymatische Reaktion mit der GLDH durchgeführt.


Urease-Reaktion:

Urease

(NH2)2CO + H2O + 2 H+ 2 NH4+ + CO2


GLDH Reaktion:

GLDH

2 NH4+ + 2 α-Ketoglutarat + 2 NADH 2 Glutamat + 2 H2O + 2 NAD+


Als Grundlage für die Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit dienen die unterschiedlichen Absorptionsspektren von NADH (340 nm und 260 nm) und NAD+ (260 nm). Wird NADH zu NAD+ umgesetzt sinkt die Extinktion bei einer Wellenlänge von 340 nm.

Im Versuch werden die Extinktionen (340 nm) bei der Reaktion von Urease mit Ansätzen verschiedener Harnstoffkonzentrationen gemessen. Die Extinktionsänderung wird dann gegen die Zeit aufgetragen. Aus dem linearen Teil des entstandenen Graphens kann dann die Steigung abgelesen werden, mit der sich die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmen lässt. Sie lässt sich mit Hilfe des Lambert-Beers-Gesetz wie folgt ermittelt:

(1)

(2)

Einesetzen der Konzentration c in (2):

Da pro mol Harnstoff zwei mol Ammonium entstehen, wodurch zwei mol NAD+ oxidiert werden, muss der Faktor 2 berücksichtigt werden:

(3)

E = Extinktion

t = Zeit in s

( )

d = Schichtdicke der Küvette (1 cm)

Im weiteren Verlauf wird ein Michaelis-Menten Diagramm erstellt, in dem die ermittelten Geschwindigkeiten gegen die tatsächliche Konzentration des Harnstoffs aufgetragen werden. Am Maximum dieses Graphen lässt sich die maximale Geschwindigkeit vmax ablesen. Wird die Hälfte von vmax bestimmt kann auf der x -Achse die Michaelis-Menten-Konstante KM, die spezifisch für ein bestimmtes Enzym ist, bestimmt werden.

Als Vergleich wird das Lineweaver-Burk Diagramm erstellt. Hier wird der Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeiten gegen den Kehrwert der Substratkonzentrationen aufgetragen. Dabei ergibt sich ein linearer Verlauf, mit dessen Geradengleichung vmax und KM rechnerischbestimmt werden können.

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Anschließend wird die Ureaseaktivität U bestimmt. 1U ist die Menge an Enzym, die die Bildung von 1 μmol NH4+ pro Minute katalysiert. Sie berechnet sich wie folgt:

U = vmax VKüvette (4)

Um weiterhin die spezifische Aktivität zu bestimmen, muss die Menge an Urease bestimmt werden. Hierzu wird die Methode nach Bradford angewendet. Dabei wird eine Kalibrierkurve erstellt, die sich durch das Auftragen der Extinktion von Rinderserumalbumin (BSA) gegen die jeweiligen Proteinmengen an BSA, ergibt.

Es entsteht ein linearer Verlauf, der eine Geradengleichung ergibt, mit der die Bestimmung des Proteingehalts verschiedener Ureaselösungen erfolgen kann. Dafür werden die Extinktionen der Ureaselösungen ermittelt, so dass die folgende Berechnung durchgeführt werden kann:

E = S m m = (5)

E = Extinktion bei 595 nm

S = Steigung

m = Masse


Mit Hilfe der Proteinmengen kann dann die Konzentration der Ureaselösungen berechnet werden.

c = (6)

Aus dem Mittelwert der Konzentrationen und der Ureaseaktivität U kann dann die spezifische Aktivität bestimmt werden:

Sp.A. = (7)


Durchführung

In Anhang 1 befinden sich die ermittelten Extinktionswerte, auf die hier Bezug genommen wird.

Tabelle 1: Bestandteile und Zusammensetzung des Reagenzienmix

Bestandteile

Zusammensetzung

Volumen

Konzentration

Lösung 1

0,6 g Urease

(mit 1 M HCl auf pH 8 eingestellt)

zu 100 ml H2O

23 ml

5,75 gL-1

Lösung 2

1,825 g α-Ketoglutarat

(mit 5 M NaOH auf pH 5 eingestellt)

zu 50 ml H2O

0,1 ml

0,152 gL-1

Lösung 3

1 mg NADH

in 1 ml H2O

0,6 ml

0,25 gL-1

Wasser


0,3 ml


Bestimmung der günstigen Verdünnung der Ureaselösung für die Kinetikmessungen:

Ureaselösung wurde 1:20 und 1:100 mit H2Obidest (2 μM Dithiothreitol und 1 mM EDTA) verdünnt. In zwei 1,5 ml Reaktionsgefäße wurden 1,2 ml Reagenzienmix, 0,02 ml GLLDH-Lösung und 0,22 ml Wasser pipettiert. Zu einem Ansatz wurde 0,01 ml Ureaselösung 1:20 Verdünnung hinzugefügt.

Dem anderen Ansatz wurde 0,01 ml Ureaselösung 1:100 Verdünnung hinzugefügt. Die beiden Lösungen wurden in eine Küvette überführt. Nacheinander wurde für beide Lösungen gleichermaßen der Leerwert bei 340 nm eingestellt. 50 μl 0,3M Harnstofflösung wurden hinzu pipettiert,vermischt und nach 15 s der erste Wert aufgeschrieben.

Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeiten

In acht 1,5 ml Reaktionsgefäßen wurden jeweils 1,2 ml Reagenzienmix, 0,02 ml GLDH Lösung, 0,22 ml Wasser und 0,01 ml Urease Verdünnung 1:20 miteinander vermischt. Die Lösungen wurden nacheinander in eine Küvette überführt und der Leerwert bei 340 nm eingestellt. 50 μl 0,03 M Harnstofflösung wurden hinzugefügt und vermischt.

Es wurden alle 15 s der Extinktionswert gemessen bis sich die Werte nicht mehr verändert haben. Der Vorgang wurde für die verbleibenden 7 Lösungen mit 0,05 M, 0,07 M, 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,5 M und 0,7 M Harnstofflösungen wiederholt.


Bestimmung der Proteinkonzentration

Zur Erstellung einer Kalibrierkurve wurde in 1,5 ml Einmalküvetten Bidestilliertes Wasser vorgelegt und mit BSA- Stammlösung nach folgendem Schema (Tabelle 2) pipettiert und vermischt:

Tabelle 2: Pipettierschema zur Erstellung der BSA-Kalibrierkurve

Bidest. Wasser [μl]

BSA-Stammlösung [μl]

Proteinmenge [μg]

100

0

0,0

99

1

1,5

98

2

3,0

97

3

4,5

96

4

6,0

95

5

7,5

94

6

9,0

93

7

10,5

92

8

12,0

Jedem Ansatz wurde 1 ml Bradford-Reagenz (1xkonzentriert) hinzugefügt und vermischt. 5 min wurden die Ansätze bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend wurde die Extinktion bei 595 nm gemessen.

Tabelle 3: Pipettierschema der Ureaseverdünnungen zur Bestimmung der Ureasemenge

Bidest. Wasser [μl]

Unverd. Urease-Lösung [μl]

97,5

2,5

95,0

5,0

90,0

10,0

Jedem Ansatz wurde 1 ml Bradford-Reagenz (1xkonzentriert) hinzugefügt und vermischt. 5 min wurden die Ansätze bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend wurde die Extinktion bei 595 nm gemessen.


Ergebnisse


Bestimmung der optimalen Verdünnung

Abb 2 Diagramm zur Bestimmung der optimalen Urease Verdünnung

Die Extinktion bei 340 nm der Urease Verdünnungen 1:20 und 1:100 wurden gegen die Zeit (in sek.) aufgetragen. Die Extinktionsänderung der 1:20 Verdünnung war nach 315 Sekunden abgeschlossen die der 1:100 Verdünnung nach 585 Sekunden.


Bestimmungder Reaktionsgeschwindigkeit


Abb 2 Diagramme zeigen die Extinktion der verschiedenen Harnstoffkonzentrationen in Abhängigkeit gegen die Zeit

Die acht Diagramme zeigen die Extinktionsänderung bei 340 nm nach Zusatz der verschiedenen Harnstoffkonzentrationen in Abhängigkeit von der Zeit (in Sekunden). Die Funktion der jeweiligen Graphen ist hier aufgeführt. Mit Hilfe der Steigung wurde die Reaktionsgeschwindigkeit der Urease bestimmt.


Berechnung für 0,03 M Harnstofflösung (mit Formel (3)):

= -(-0,0042) = 0,339 μmol∙L-1∙s-1


Berechnung der tatsächliche Harnstoffkonzentration:

ctat = (8)

ctat = = 0,001


Die berechneten Werte wurden zur Erstellung des Michaelis-Menten und Lineweaver-Burk Diagramm verwendet:

c [mol∙L-1]

[s-1]

ctat [mol∙L-1]

v0 [μmol∙L-1∙s-1]

[L∙mol-1]

[s∙L∙μmol-1]

0,03

-0,0042

0,0010

0,339

1000

2,950

0,05

-0,0051

0,0016

0,411

625

2,433

0,07

-0,0058

0,0023

0,468

434,78

2,137

0,1

-0,0064

0,0033

0,516

303,03

1,938

0,2

-0,0076

0,0067

0,613

149,25

1,631

0,3

-0,0083

0,0100

0,669

100,00

1,495

0,5

-0,0088

0,0167

0,710

59,88

1,408

0,7

-0,0090

0,0233

0,730

42,92

1,379

Zur Erstellung des Michaelis-Menten Diagramm wurden die zuvor berechneten Geschwindigkeiten gegen die tatsächliche Konzentration der Harnstofflösungen aufgetragen.


Abb 3 Michaelis-Menten Diagramm mit graphischer Bestimmung von vmax und KM

vmax und KM konnten graphisch ermittelt werden:

Die Maximale Geschwindigkeit vmax liegt bei0,76 μmol∙L-1∙s-1. KM wurde bei der Hälfte der Maximalen Geschwindigkeit auf der x-Achse abgelesen und liegtbei 1,35∙10-3 mol∙L-1

Für das Lineweaver Burk Diagramm wurde der Kehrwert der berechneten Geschwindigkeiten gegen den Kehrwert der tatsächlichen Harnstoffkonzentration aufgetragen.


Abb 4 Lineweaver-Burk Diagramm


Rechnerische Ermittlung von vmax und KM aus dem Lineweaver-Burk Diagramm

vmax:

= 0,0017∙0 + 1,3583 s∙L∙μmol-1

vmax = 0,736 μmol∙L-1∙s-1


KM:

0 = 0,0017 + 1,3583 s∙L∙μmol-1

= -799 Lmol-1

KM = 1,2510-3 μmolL-1 = 1,25 mmolL-1


Zur Ermittlung der Enzymaktivität wurde die Bradford Kalibrierkurve erstellt. Hierfür wurden die Extinktion von Rinderserumalbumin (BSA) Lösungen bekannter Konzentration gegen die Proteinmengen an BSA aufgetragen

Abb 5 Bradford Kalibrierkurve bei der Extinktion des BSA gegen die Proteinmenge aufgetragen wurde

Es ist ein linearer Verlauf entstanden, mit dessen Geradengleichung die Proteinmengen der Urease Verdünnungen bestimmt werden.


Berechnung der Proteinmenge der Urease Verdünnungen:

E = S m m =

E = Extinktion bei 595 nm

m = Masse

m (2,5μl Urease Verdünnung) = = 1,316 μg

m (5,0 μl Urease Verdünnung) = 2,105 μg

m (10,0 μl Urease Verdünnung) = 4,378 μg


Berechnung der Proteinkonzentration

c =

c (2,5 μl) = = 0,526

c ( 5,0 μl) = 0,421

c (10,0 μl) = 0,4378

Mit Hilfe der Geschwindigkeiten und den berechneten Konzentrationen wurde anschließend die Enzymaktivität U und die spezifische Aktivität sp.A. berechnet.


Berechnung der Enzymaktivität U


U =

U = vmax VKüvette


Michaelis Menten:

U = 0,765 μmol∙L-1∙s-1 ∙ 60 ∙ 0,0015 L = 0,06885


Lineweaver- Burk:

U = 0,0662


Berechnung der spezifischen Aktivität sp.A.


Sp.A. =

= c (2,5 μl) + c (5,0 μl) + c (10,0 μl)

= 0,526 + 0,421 + 0,4378 = 0,4617


Michaelis Menten:



Lineweaver-Burk:


Sp.A.: 0,287 = 287


Tabelle 5: ZUsammenfassung der berechneten Werte


Michaelis-Menten

Lineweaver-Burk

KM

1,35∙10-3 mol∙L-1

1,2510-3 μmolL-1

vmax

0,765 μmol∙L-1∙s-1

0,734 μmol∙L-1∙s-1

Aktivität U

0,06885

0,0662

Spezifische Aktivität

0,298

0,287

Diskussion

Die Urease Verdünnung 1:20 hatte ihre Extinktionsänderung bereits früher abgeschlossen als die 1:100 Verdünnung. Hier wurde NADH schneller zuNAD+ umgesetzt, zu Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit der Urease wurde daher die 1:20 Verdünnung verwendet.

Mit den aus den Reaktionsgeschwindigkeiten und tatsächlichen Harnstoffkonzentrationen erstelleten Diagrammen, konnten erfolgreich die maximale Geschwindigkeit und die Michaelis Menten Konstante bestimmt werden. Die Werte des Michaelis Menten Diagramm für vmax und KM sind dabei größer (KM: 8 % ; vmax: 4,2 %), als die des Lineweaver Burk (LB) Diagramm.

Die ermittelten Werte für den KM Wert von 1,35 mM (MM) und 1,25mM (LB) liegen sehr nah beim Literaturwert2 von 1,3 mM (3,85 % Abweichung). Kleine Abweichungen können beim manuellen bestimmen der linearen Geradengleichungen entstanden sein, wodurch die Steigung und letztlich die Geschwindigkeit fehlerhaft berechnet werden können.

Desweiteren können Pipettierfehler und fehlendes Durchmischen der Lösungen Abweichungen verursachen.

Die bestimmten Werte (MM: 289000 U/g und LB: 286000U/g) für die spezifische Aktivität weichen stark vom Literaturwert2, der bei 15000-50000 U∙g-1 liegt, ab. Diese Abweichungen können durch falsches Pipettieren entstanden sein oder durch falsches Ansetzen der Verdünnungen.


Quellen

1) Reaktionsgleichung aus dem Praktikumsskript Biochemische Arbeitstechniken BA-5 S.39

2) Literaturwerte der Urease: aldrich/docs/Sigma/Data


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