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Einführung in die Molekularbiologie

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Biology

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Karl-Franzens-Universität Graz - KFU

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Molekularbiolog­ie Transposition Bei DNA-only Transposons wird zwischen der konservativen Transposition und der replikativen Transposition unterschieden. Während bei der konservativen Transposition das Transposon aus der DNA herausgeschnitt­en und an anderer Stelle wieder eingebaut wird (cut & paste), wird bei der replikativen Transposition das Transposon nicht herausgeschnitt­en,­ sondern eine Kopie erstellt, die an anderer Stelle eingebaut wird (copy & paste). Bei der replikativen Transposition wird die Anzahl…
FRAGENKATALOG MIKROBIOLOGIE  1.Mikroskopiere­n und kultivieren  Durch welche Methoden kann man im Mikroskop mehr sehen? Färben  Fokussieren­ Phasenring  Ölimmersion­­  Phasenring Phasenkontrast kann man mit nahezu jedem Mikroskop machen. Dazu sind nur ein Objektiv mit einem Phasenring und eine in der Größe passende Ringblende im Kondensor notwendig. Der Phasenring besteht aus einer Verzögerungspla­tt­e ( /n-Plättchen) und einem Graufilter. Das /n-Plättchen bremst das direkte Licht ab und vergrößert damit…

EINFÜHRUNG IN DIE MOLEKULARBIOLOGIE

Aufbau und Struktur der Nukleinsäuren, DNA:

DNA ist ein Polymer aus Nukleotiden (Nukleosid mit angeesterter

Phosphorsäure). Das C1 der Ribose ist N-glycosidisch mit einer Pyrimiden-

bzw. Purinbase verbunden, am C2 der DNA fehlt der Sauerstoff, C3 bindet an

Phosphat der vorhergehenden Nukleotids u. am C5 sitzt das Phosphat.

Bei physiologischem pH ist das Phosphat-Backbone vollständig deprotoniert.

Bei dsDNA bilden Purinbasen mit Pyrimidenbasen H-Brücken aus. Meistens

bilden ds Nukleinsäuren rechts-gängige Helices aus. Pro Umdrehung der Helix

liegen 10,4 Basen vor. Man unterscheidet die Major Groove von der Minor

Groove, da sich die N-glykosidischen Bindungen eines Basenpaares nicht exakt

gegenüberstehen (Tilt, Roll, Helical Twist, Propeller Twist). Auch die

Basenabfolge bestimmt die Helixstruktur.

Die DNA-Sequenz kann nach Maxam & Gilbert chemisch

sequenziert, oder nach der Sanger-Methode sequenziert

werden (ddNTPs, Primer, DNAPol).

Als codierenden Strang bezeichnet man die DNA-Sequenz

von 5’ nach 3’. Der Template- od. Antisense Strang ist die

komplementäre 3’-5’ Sequenz.

Man kennt verschiedene Sequenzmotive: Repeats, Palindrome,

Inverted Repeats (führen zu Hairpins). Hairpins sind umso

stabiler, je länger sie sind, je weniger Fehlpaarungen sie haben,

je geringer die Looplänge und je höher der G/C-Gehalt ist.

DNA kann durch Säure denaturiert werden Amino-Imino

Tautomerisierung von A u. C), durch Alkali (Keto-Enol

Tautomerisierung von G u. T) od. durch Hitze. Die

Schmelztemperatur ist abhängig vom G/C-Gehalt, der Salzkonzentration im Medium u. dem Gehalt an org. Lösungsmittel. ssDNA zeigt höhere Absorption als dsDNA Hyperchromizität.

Eukaryontische DNA renaturiert in mehreren Phasen: Zuerst die hochrepetitive (Satelliten), dann

die

mittelrepetitive (z. B. rDNA, Line u. Sine), dann nichtrepetitive DNA.

Man unterscheidet 3 Klassen von Satelliten DNA:

Mikrosatelliten sind am

Chromosom verteilt u. zeigen

10 - 50 Repeat-Kopien in Folge (Short

Tandem Repeats, VNTRs). Ein Repeat ist

1 - 13 bp lang.

Minisatelliten befinden sich an den Telomeren. Ein Repeat ist

9 - 64 bp lang, ein Block bis zu 20 kbp.

Satelliten finden sich im Heterochromatin u. im

Centromerbereich. Ein Repeat ist 5 - 171 bp lang,

ein block bis zu 100 kbp.

Zur mittelrepetitiven DNA zählt man

LINE,

SINE,

LTR,

DNA-Transposons:

21 % des Genoms sind LINE-Elemente, die 6 - 8 kbp lang sind. Sie liegen in 850.000 Kopien vor.

SINE-Elemente machen 13 % aus u. sind 100 - 300 bp lang. Sie liegen in 1.500.000 Kopien vor.

Bei der DNA-Topologie kennt man positive u. negative Superhelicität u.

relaxed DNA. Verknüpfungszahl Lk = Wr + Tw (und: Tw = Anzahl der Basenpaare / 10,5).

Topoisomerasen verändern die DNA-Topologie. Dies ist wichtig zur Verhinderung topologischer Spannungen bei Transkription und .....[read full text]

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Bakterielle Chromosomen werden durch histonlike Proteins (HU, IHF, H-NS, FIS, Hfq, Dps, SMC-Protein: MukB) verpackt.

DNA-Replikation:

Virale Genome sind 5 - 200 kbp lang, das E. coli Genom ist 4,6 Mbp groß (1 Gen ~ 1 kbp), Hefe

hat 13,5 Mbp und der Mensch 3,2 Gbp.

Die Replikation chromosomaler DNA erfolgt bidirektional nach Theta-Modus in 5’-3’ Richtung.

Die 3’-OH Gruppe macht einen nukleophilen Angriff auf das .-Phosphat des nächst einzubauenden dNTPs. Die Leading Strand Synthese erfolgt kontinuierlich, die Lagging Strand Synthese über Okazaki Fragmente diskontinuierlich.

E. coli hat benötigt zur Replikation die Helicase (DnaB), Primase, SSBs, Gyrase, DNAPol III, DNAPol I und die Ligase:

SSBs binden hoch kooperativ 33 - 55 Basen; dies verhindert Bindung der Primase, erhöht die Replikationsgeschwindigkeit, schützt ssDNA usw.

Helikasen entwinden dsDNA; pro ATP 5 - 12 bp.

DNA-Polymerasen haben eine Daumen-, Finger- u. Handballendomäne u. zwei Mg2+ Ionen. Ein Mg2+ schirmt die negativen Ladungen der .- u. .-Phosphate der neuen dNTPs ab, das zweite Mg2+ wechselwirkt mit dem 3’ OH des letzten Nukleotids u. erhöht dessen Elektronegativität, wodurch

es besser an das nächste dNTP bindet. Die DNAPol I synthetisiert 20 nt/s u. hat eine Prozessivität 3 - 200. Die DNAPol III erzeugt 750 nt/s bei einer Prozessivität von mind. 500.000. Die DNAPol IV u. V sind „error prone“.

Die DNAPol I besteht aus drei Domänen: 5’-3’ Exonuklease (Primerabbau), 3’-5’ Exonuklease (proof reading) u. Polymerase. Die letzten beiden bezeichnet man als Klenow Fragment (für Nick Translation, Random primed Labeling od. Primer Extension in der Forschung verwendet).

Die DNAPol III besteht aus mehreren Untereinheiten:

Die .-UE hat Polymerase-Aktivität.

Die .-UE bedingt als Sliding Clamp die hohe

Prozessivität; sie bleibt am Lagging Strand zurück u.

interagiert auch mit Pol I u. Ligase bzw. mit Pol IV,

sollte bei Fehlern Pol III abfallen.

Die .-UE stimuliert die .-UE proof reading-Aktivität.

Die .-UE dient als 3’-5’ Exonuklease, die .-UE der

Dimerisierung durch Modulation der ./.-

Wechselwirkungen und der DnaB-Aktivierung für die

Replikation v. SSB-beladener DNA (mit anderen UE).

Der .-Komplex (., .’, ., ., .) macht als Clamp Loader

einen Knick in ssDNA .....

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wird eine verfrühte Reinitiation durch Binden von ATP-DnaA am OriC verhindert. Die Hydrolyse des ATP-DnaA zu ADP-DnaA wird durch Hda u. Sliding Clamp der Pol III katalysiert.

Zur Termination der Replikation kommt es dadurch, dass Tus an Ter-Sequenzen bindet. Die Helikase kann Tus nur aus einer Richtung kommend passieren; die Ter-Sequenzen sind so lokalisiert, dass es sicher zur Replikation des gesamten Genoms kommt.

In Eukaryonten gibt es mehrere, dafür kürzere, Replikons als bei Bakterien. Wichtige Polymerasen bei Säugern sind die Pol . (Primase), die Pol . (DNA-Synthese) u. die Pol . (Reparatur). Pol . u. Pol . haben beide proof

reading-Aktivität u. arbeiten vermutlich zusammen (je eine Pol für Leading od. Lagging

Strand).

Weiters werden PCNA (als Clamp), Replication Factor C (als Clamp Loader), Replication Factor A (als SSB), die Topoisomerasen I u. II, MF1 (entfernt RNA), DNA-Ligase I u. RNaseH (schneidet RNA klein) benötigt.

Replikationsursprung ist in der Hefe ARS (Autonomously replicating Sequences) mit einer A/T-reichen Consensussequenz. In Säugern heißt der Ursprung OBR (Origin of bidirectional Replication), woran der ORC (Origin Recognition Complex) bindet. Dieser ist das eukaryontische Gegenstück zu DnaA-Proteinen der Bakterien.

Die Replikation geschieht in der S-Phase des Zellzyklus. Eine wichtige Rolle spielen Cycline, die CDK (Cyclin dependent Kinase) aktivieren. CKIs inaktivieren CDKs an Checkpoints im Zellzyklus. Der Übergang von der G1-Phase zur S-Phase wird durch .....

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Cyc.E-Dck2 inhibiert.

Am Leading Strand-Ende kommt es zu einem Run-off der Pol a, doch am Lagging Strand-Ende käme es zu einer Verkürzung. Wiederholte Telomer-Sequenzen (TTAGGG) schützen daher die Enden (2 - 30 kb). Die TERT (Telomerase / Reverse Transkriptase) verlängert die Telomere über ein RNA-Template um einen 200 - 200 ssDNA 3’-Überhang. Dieser bildet eine T-loop wobei ein

Teil des Strangs verdrängt wird (durch POT1 geschützt) u. kein freies 3’-OH mehr exponiert ist.

DNA-Bindeproteine, DBPs:

Helix-Turn-Helix Proteine binden oft als Dimer an die Major Groove u. haben daher palindrome Erkennungssequenzen. Sie kommen hptsl. in Prokaryonten vor (Cro, LacI, TrpR), aber auch in Eukaryonten (Homeodomäne).

Zink-coordinierende Proteine erkennen 3 nt in der Major Groove. Führ höhere Spezifität folgen oft mehrere Zinkfingerproteine der Major Groove auf der DNA. Der . Zinkfinger hat Zink zur Proteinstabilisierung gebunden (oft DNA-RNA-Wechselwirkungen). Hormonrezeptoren des Zytoplasmas wandern bei Liganden-Bindung in den Kern u. binden an DNA.

Zipper-Proteine (Leucin Zipper, Helix-loop-Helix) binden über eine basische N-term.....

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Die E. coli RNAPol setzt sich zusammen aus zwei .-UE, einer .- u. einer .’-UE, der .-UE u. dem .-Faktor. Der .70-Faktor erkennt den Promotor der House keeping Genes.

.-Faktoren der Klasse 1 bestehen aus verschiedenen Domänen: 1.1 verhindert eine Bindung des Faktors ohne RNAPol an die DNA. 2.4 erkennt -10 Region usw.

Der Sigmafaktor E erkennt Promotoren für HSPs bei starkem Hitzeschock; er wird unter Normalbedingungen durch einen Anti-Sigmafaktor an die Membran gebunden. Sigma 32 erkennt HSP-Promotoren bei leichtem Hitzeschock; seine mRNA bleibt nur unter Hitzestress in der Zelle

stabil. Sigma 54 benötigt zum DNA-Aufschmelzen (als AAA-Protein ATP-abhängig) im RNAPol Holoenzym EBP auf einer Upstream activating Sequence (UAS).

Die DNA wird, nach Bindung an den Promotor, in der -10 Region aufgeschmolzen, die saure .1.1-

Domäne klappt aus dem Holoenzym heraus u. .3.2 Loop bindet das 1. Nukleotid (kein Primer nötig). Es werden bis zu 6 Nukleotide RNA synthetisiert und freigesetzt (abortative Initiation).

Erst bei Promotor Clearance wird der Sigmafaktor freigesetzt (.3.2 verdrängt u. die RNA durch Exit Channel ausgeschleust) u. die Elongationsphase beginnt.

Bei der Elongation bewegt sich die Transkriptionsblase an der DNA entlang. An die neue mRNA binden sofort Ribosomen u. beginnen mit der Translation.

Die intrinsische Termination (Rho-unabhängig) erfolgt durch Bildung eines G/C-reichen Hairpins, gefolgt von 6 - 7 U. Der Terminationsfaktor NusA verhindert Bindung der mRNA an UBS der RNAPol. NusA u. Sigmafaktor können nicht gleich.....

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Bei der positiven Kontrolle der Transkription kann entweder ein inaktiver Aktivator durch einen Induktor aktiviert werden (Induktion), oder ein aktiver Aktivator wird durch einen Corepressor inaktiviert (Repression).

So aktiviert z. B. CAP mit cAMP (bei Glucosemangel) die Transkription des lac-Operons.

Bei der negativen Kontrolle kann entweder ein Repressor durch einen Induktor inaktiviert werden (Induktion), oder ein inaktiver Repressor wird durch einen Corepressor aktiv (Repression).

Der lac-Repressor LacI bindet in Abwesenheit von Lactose als Dimer an je einen v. drei Operatoren im lac-Operon (binden 2 Dimere, kommt es zur Tetramer-Bildung); Allolactose od.

IPTG inaktivieren LacI u. führen zur Induktion.

Bei Anwesenheit v. Tryptophan als Corepressor bindet TrpR an den Operator des Trp-Operons (u. auch an seinen eigenen Operator). Außerdem gibt es eine Regulation des Trp-Operons durch Attenuation: Wenn wenig Trp vorhanden ist, benötigt das Ribosom, das der RNAPol auf der neu gebildeten mRNA folgt, länger beim Einbau von Trp (mehrere Trp-Codons hintereinander); das

bewirkt die Ausbildung von Terminations-Hairpins. Ist viel Trp vorhanden, dann pausiert das Ribosom bei der Translation nicht u. diese Hairpins werden nicht gebildet.

Die Promotorstärke kann durch Fusionsproteine od. Farbnachweis mit chromogenen od. luminogenen Substraten bestimmt werden. Cis-aktive Promotorelemente werden durch Deletionsanalysen bestimmt (bei Deletion einer Aktivator-Bindestel.....

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