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Biology

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Karl-Franzens-Universität Graz - KFU

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3, Fröhlich, 2012

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Das lacI- Gen wirkt dagegen in trans, da es über ein diffusibles Produkt, das Repressorprotei­n, arbeitet. Ein unmutiertes lacI kann alle lac- Operons der Zelle abschalten, unabhängig davon, ob sie auf der selben DNA liegen wie es selbst, oder nicht. Initiation der Transkription: Das Umschreiben der DNA in RNA wird von RNA- Polymerasen durchgeführt. Bei Bakterien ist es ein großer Komplex aus den Untereinheiten 2x α, β, β’ und Initiationsfakt­or σ. Der Sigma- Faktor erkennt den Promotor. Die Kennseqzuenzen liegen jeweils 35 und 10…
Einführung in Genetik - Zusammenfassung von Kapitel 1 - 3 Kapitel 1 Populationsgene­tik untersucht die Artenbildung (Neubildung, Rekombination, Kreuzung). Anfänge der Genetik Robert Hooke 1665: Alle Lebewesen bestehen aus kleinen Teilen (Zellen, benannt nach dem Raum für Mönche). Chromosomen (wörtlich: Farbteilchen) lassen sich gut mit basischen Farbmitteln einfärben, da sie selbst sauer sind. Miescher 1871: Extraktion von Chromatin aus Eiter; entdeckte Nucleinsäuren und ihre Einförmigkeit, weswegen er Proteine als…

Physikalische Eigenschaften der Nukleinsäuren


Die Fähigkeit der DNA-Einzelstränge sich unter geeigneten Temperatur- und Ionenbedingungen wieder zu einem Doppelstrang zusammenzufügen nennt man Renaturierung oder Reassoziation. Die durch die Renaturierung gebildeten Moleküle heißen Hybridmoleküle und den Vorgang der Doppelstrangbildung Hybridisierung.

Wenn sich Hybridmoleküle nicht ganz komplementär paaren kommt es zu Fehlpaarungen, den resultierenden Doppelstrang nennt man Heteroduplex. Dieser ist extrem instabil.

Die Stabilität lässt sich mit einer thermischen Denaturierung feststellen, je mehr ungepaarte Basenpaare, desto niedriger ist der Schmelzpunkt.

Reaktionskinetiken verdeutlichen (Grafik S. 30) mit einer cot-Kurve, wie oft sich DNA-Sequenzen wiederholen. Mehrere Abstufungen bedeuten mehr repetitive Sequenzen, was auch die Komplexität des Strangs verringert.


Replikation der DNA


Replikationsproteine bei Prokaryoten (Ringförmige DNA)


Name

Funktion

Info

DnaA (1 Untereinheit)

Erkennung der Startsequenz

Bindet an seine Erkennungssequenz am oriC (DnaA box), führt zu Initiationskomplex u zur Entwindung der DNA am linken Bereich von oriC durch Spannung.

DnaC (1 Unterheinheit)

Beladende Helikase

Sorgt durch sein ATP für Bindung von DnaB an DNA.

DnaB (1 Untereinheit)

Replikative Helikase

Aufwinden des Doppelstranges

Topoisomerase Typ 1

Entfernt supercoil

Induziert Strangbrüche 1 Stranges um Verdrillung zu vermeiden. Windungszahl um 1 erhöht somit ist negatives supercoiling aufgehoben.

Topoisomerase Typ 2

Entfernt supercoil

Bricht den Doppelstrang und reduziert die Windungszahl auf 2, erzeugt negatives supercoiling, braucht ATP

Gyrase


Siehe Toposisomerase Typ 2

SSB (1 Untereinheit)

Einzelstrangbindend

Bindet an den Einzelstrang und verhindert erneute Paarung des Stranges (60 Nukleotide abgedeckt)

DnaG (1 Untereinheit)

Primase

RNA-Polymerase die den Primer erzeugt

Polymerase 3 (3 UE)

Polymerase

Synthetisiert den 2. Strang eines Stranges

Gamma-Komplex (5 UE)

Klammerlader

Lädt die Klammer auf die DNA unter ATP-Verbrauch

Beta-UE

Klammer

Hält Pol 3

Polymerase 1

Entfernen des Primers

Lückenschließung von Pol 3

RNase H

Entfernen des Primers

Erkennt RNA-DNA-Heteroduplexe

DNA-Ligase

Reifung des lagging strang

Verknüpfung der Okazakis durch Esterbildung

Phasen der Replikation bei Prokaryoten


Initiation


Die Regulation der Replikation läuft in der Initiationsphase des Zellzyklus ab. Initiation beginnt mit dem aufdrillen der DNA durch Topoisomerasen, der oriC mit AT-reichen Consensus-Sequenz wird ermittelt usw. und schließt mit der Bildung des Primers ab.

Die Proteine IHF und FIS binden an einen Abschnitt des oriC und sorgen für eine Beugung in der DNA, was die Bindung von DnaA unterstützt.


Elongation


Beginnt mit der Synthetisierung des Stranges durch Pol 3 bis zur Schließung des Stranges durch die Ligase. Die von Pol 3 benötigten Nukleotide liegen frei in der Zelle vor.


Termination


Bei einer linearen DNA stoppt die Replikation mehr oder weniger von selbst da sie einen Anfang und ein Ende hat. Bei einer Ringförmigen DNA finden sich Terminationssequenzen an die das Protein TUS bindet und damit die Helikase stoppt.


Replikationproteine von Eukaryoten (Lineare DNA)

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Name

Funktion

Info

ORC (6 UE)

Erkennung der Startsequenz

Startbereich, EK haben mehrere Origins.

CDC6 (1UE)

Beladende Helikase

In Verbindung mit ORC für den zeitl. Kontrolle der Initiationsphase.

MCM (6UE)

Replikative Helikase

Manche UE binden an einzelsträngige DNA, Helikaseaktivität

Topoisomerase I und II



RP-A (3 UE)

Einzelstrang bindendes Protein


Pol alpha / Primase

Primase


Pol delta und weta

Polymerase


RF-C (5 UE)

Klammerlader


PCNA

Klammer


FEN-1, RNase H

Enfernen des Primers


DNA-Ligase I

Reifung des lagging strangs


Phasen der Replikation bei Eukaryoten


Initiation


Der einzige Unterschied zu Prokaryoten besteht darin, dass Eukaryoten mehrere Origins besitzen und nur lineare DNA. Der Vorteil ist, dass die Replikation des Stranges durch eine höhere Anzahl von SSBs langsamer und somit genauer verläuft, außerdem in das Kontrolllesesystem von Pol 3 um einiges Komplexer. Durch die höhere Anzahl an Origins verläuft die Replikation im Allgemeinen schneller.

Die Origins haben keine spezielle Sequenz sondern eine Consensus-Sequenz und werden durch den Origins-Erkennungs-Komplex ORC, CdC6 und MCM Proteine markiert.

Im Allgemeinen ist die DNA von Eukaryoten stärker verpackt und vor allem auch größer als jene von Prokaryoten.

Der weitere Initiationsverlauf und die Elongation verlaufen identisch.


Termination


Terminatle Sequenzen wurden bisher nicht entdeckt, wären auch nicht notwendig da der Strang ein Ende hat. Eukaryoten besitzen Telomere an den Enden des Stranges, welche keine Nukleotide besitzen, somit ist die vollständige Synthese nicht möglich. Bei jeder Zellverdoppelung verkürzen sich diese Telomere, die aus repetitiven Sequenzen besteht und keine Strukturgene besitzt.

Vermutlich wird die Telomer-Region für das altern zuständig sein da sie bei jedem Replikationsvorgang instabiler wird.

Bei Stammzellen, Keimzellen und Tumorzellen wurde das Enzym Telomerase (Reverse Transkriptase) entdeckt, welches diesen Verlust kompensiert.


Replikation nach dem rolling-circle-Prinzip


Tritt bei einigen Viren und Plasmiden auf. Wenn eine ringförmige DNA vorliegt, wird der äußere Strang (Plus-Strang) geöffnet und das 3 OH Ende dient als Primer für de Replikation des inneren (Minus-Strang) Stranges. Der Minus-Strang dient dient als Vorlage und wird kopiert, somit wird an der Bruchstelle des Plus-Stranges polymerisiert d.h. er wird verlängert.

Liegt der Strang einzelnd vor, wird zuerst ein Doppelstrang gebildet.


Transkription von mRNA


Die Transkription bildet zusammen mit der Translokation die Genexpression einer Zelle.


Transkription bei Prokaryoten (mRNA)


Findet im Cytoplasma statt.


Initiation:


In der Initiationsphase der Transkription wird im Gegensatz zur Replikation kein Primer oder Consensus-Sequenz mehr benötigt, stattdessen wird der Promotor definiert.

Prokaryoten verfügen über nur eine RNA-Polymerase, welche sich aus zwei Komponenten zusammensetzt:


  1. Core-Enzym aus 2αββ´

  2. σ-Faktor welcher die Promotorstruktur erkennt


Beide zusammen, das Core-Enzym und der σ-Faktor bilden das Holoenzym welches an die DNA bindet und die Initiation einleitet.

Nun fällt der σ-Faktor vom Rest des Komplexes ab, erste Nukleotide werden gebildet und die Elongation wird eingeleitet


Siehe Zeichnung „Promotorstuktur“


Elongation:


Die DNA wird entspiralisiert und mit Hilfe von Helicasen werden die Basenpaare erneut getrennt. Die RNA-Polymerase fügt die komplementären Basen des sogenannten Antisense-Strangs an, nur dass statt Thymin Uracil genommen wird. Es wird nicht der gesamte DNA-Strang bearbeitet sondern nur Teile davon.


Termination:


Die Termination erfolgt entweder durch eine Terminationssequenz oder durch den Terminationsfaktor p.


Transkription bei Eukaryoten (mRNA)


Findet im Zellkern statt.


Initiation:


Siehe Zeichnung „Eukaryotische Transkription“

Am Ende der Initiation wird eine Cap-Struktur am 5´Ende der mRNA synthetisiert. Diese schützt die mRNA vor Abbau und dient als Signal für die Ausführung aus dem Zellkern. Dabei erzeugt das Capping-Enzym eine 5´5´Phosphodiesterbindung an 5´Ende der mRNA und an die 7. Position des Guanins mit Hilfe von mRNA-Methytransferase. Auch die erste Base wird methyliert.


Elongation:


Danach erfolgt das Splicing, d.h. der Abtrennung von Introns von den Exons (siehe Splicing bei Eukaryoten).


Termination


Nach dem Splicing erfolgt die Polyadenylierung. Dabei wird das 3´Ende der mRNA polyadenyliert und mit einem Poly-A-Schwanz versehen. Es ist ein Polyadenylierungssignal (AAUAAA) notwendig welcher vom Protein CPSF erkannt wird.

Der Poly-A-Schwanz wird von einer Poly-A-Polymerase angeknüpft und das Poly-A-binding-protein setzt sich auf den Fortsatz, da es für die Translation notwendig ist.


Transkription ribosomaler Gene


Da bei der Transkription nur einzelnde Abschnitte der DNA transkribiert werden, gibt es auch einen eigenen Abschnitt auf der DNA auf dem ribosomale Gene sitzen. Dieser Abschnitt wird anderes transkribiert als alle anderen.



Es gibt 3 rRNAs : 5S-, 5,8S-, und 23S rRNA.

In der Regel handelt es sich um Einzelstränge aber manchmal sind sie doppelt.

Es findet keine Prozessierung statt, auch da Prokaryoten keine Introns besitzen.


Bei Eukaryoten:


Zuerst wird eine prä-mRNA oder hnRNA gebildet, eine stinknormale mRNA welche noch bearbeitet, prozessiert werden muss.

Da bei der Transkription ein ganzer Abschnitt kopiert wird, sind auch alle Exons (Protein-codierend) und Introns (nicht codierend) vorhanden. Die Introns werden in einem Prozess namens Splicing von Endonukleasen weggeschnitten und somit sind nunmehr alle notwendigen Gene vorhanden. Um bestimmte Bereiche zu schützen, werden manche Abschnitte methyliert um sie vor Abbau zu schützen.


Splicing


Bei Eukaryoten:


Typ III bei Protein-kodierenden Genen


Bei Eukaryoten findet man zahlreiche Exons und Introns und die gilt es zu splicen.

Mit Hilfe von Enzymen, den Spliceosomen, welche sich an die 3´und 5´- Enden der Introns anlagern werden unbrauchbare Abschnitte herausgeschnitten. Die Splicosomen hängen sich an ihre Erkennungssequenzen GT am 5´ und AG am 3´Ende der DNA.


Typ I autokatalytisches Splicing bei nicht Protein-codierenden Genen


Tritt bei prä-rRNA Eukaryota, prä-mRNA in Mitochondrien auf. Dabei findet ein Angriff eines Guanosins auf die 5´splice-site statt. Darauf greift die 3´Hydroxy-Gruppe auf der 5´des Exons die 3´splice site an, dadurch werden die beiden Exons unter Freisetzung des Introns miteinander verbunden. Das Intron schließt sich dann zu einem Ring.


Typ II autokatalytisches Splicing bei nicht Protein-codierenden Genen


Findet sich in prä-mRNAs in Mitochondrien und Pilzen. Dabei greift ein an der 3´splice-site gelegenes Andenosin mit seiner 2´Hydroxy-Gruppe die 5´splice-site an. Dadurch entwickelt sich eine 2´5´Phosphodiesterbindung wodurch das Intron eine Lassoförmige Struktur, ein Lariat annimmt. Darauf greift wieder die 5´splice-site die 3´splice-site an und die Exons verbinden sich.


Translation


(siehe Zeichnung)


Proteine nach der Translation


Posttransionale Modifikation (nach der Translation)


Die nach der Translation entstandenen Proteine müssen sich jetzt falten und damit sie in ihren hydrophoben Bereichen nicht zusammenkleben helfen ihnen Chaperons (= Hitzeschockproteine). Diese legen sich über die hydrophoben Bereiche und umschließen sie. Dabei wird ATP verbraucht. Peptidyl-Prolyl-Isomerasen helfen durch Rotieren von Rolinresten um ihre Peptidbindungen um das Falten zu beschleunigen.


  • Glycolisierung im ER und Golgi-Apparat, ein Saccharid wird an ein Lipid oder Protein angehängt.

  • Anhängen von Phosphatresten und Lipiden

  • Durch anhängen von Lipidankern wie Fettalkohole, Fettsäuren und Glycoproteinen verankern z.B. Proteine an der Membran.


Das F-Plasmid


Bakterien sind durch Plasmide zur Rekombination fähig indem sie sexuelle Prozesse durchführen. Durch Paarung (Konjugation) ändern Bakterien ihren Genotyp durch unidirektionalen Transfer des Bakteriengenoms. Aber dies ist nur möglich wenn einer der Konjuntionspartner ein ringförmiges DNA Element namens F-Plasmid bzw. Plasmid besitzt. Sie können sich selbst replizieren sind aber vom Stoffwechsel der Zelle abhängig.


Ein Plasmid wird nur einmal pro Zellzyklus repliziert und während der Konjugation erfolgt dies über das rolling-circle-prinzip. Sex-Pili werden von der Zelle gebildet und so hängen sich F- (ohne Plasmid) an F+ Zellen.


Wenn eine DNA-Sequenz-Homologie zwischen Plasmid und dem Chromosom besteht, können sich Plasmide auch dort integriert werden. Eine Homologie erstellt ein Transposon das im Plasmid wie auch im Chromosom vorkommt.


Hfr-Zellen


Bezeichnet man jede Zellen in deren Chromosom ein F-Plasmid integriert worden ist. Nach dem Einzelstrangbruch am oriT (Startpunkt am Plasmid-DNA) wird ein 5´Ende von der Donor- in die Empfängerzelle übertragen. Das heißt aber das die Empfängerzelle nun eine zusätzliche bakterielle DNA enthält = Erstellung einer Chromosomkarte für Bakterien.


Kontrollmechanismen (Regulation der Genexpression)


Positive Genkontrolle ist das Anschalten eines Stoffwechselgens bei Bedarf. Man braucht einen Induktor.

Negative Genkontrolle ist das Abschalten eines Stoffwechselgens wenn eine Substanz ausreichend vorhanden ist und so nicht synthetisiert werden muss. Es ist ein Repressor notwendig.

Aminosäuren und Lactose z.B. können sowohl als Substrat als auch als Repressor oder Induktor wirken.


Eine konstitutive Expression bezeichnet man ein Gen das nicht mehr regulierbar, sondern kontinuierlich aktiv ist und das in einem positiven Regulationssystem.


Eine Mutation in cis-Stellung bedeutet eine Wirkung auf dem gleichen Chromosom auf dem ein Gen exprimiert wird.



E.coli Zelle brauchen Lactose als Kohlenstoffquelle. Wenn auf diesem Gen eine Mutation vorliegt bezeichnet man sie als Genotyp lac- (Phänotyp ist Lac+).

Zwei lac-Mutationen ergeben 2 Komplementationsgruppen lacZ und lacY. lacZ kodiert das Enzym zum Lactoseabbau (beta-Galactosidase), lacY kodiert für den Transport der Lactose durch die Zellwand ins Zellinnere, deshalb wird sie auch Permease genannt. lacA kodiert ein weiteres Enzym des Lactosestoffwechsels, die Transacetylase (nur Induktor, kein Substrat somit wird es nicht abgebaut).

(für lacI, lac-Operon und Vorgang siehe Zeichnung)


Oc-Mutaten


Führen zu einer konstitutiven Exptrssion der beta-Galaktosidase und sind von lacI unabhängig, selbst wenn diese mutiert sind. O-Mutationen sind nur cis wirksam. Die O-Region wird als Operator bezeichnet und bindet den Repressor. D.h. Mutationen die nur cis wirksam sind und zur konstitutiven Expression eines Gens führen weisen auf eine Anwesenheit einer Regulationsregion hin (Operator).


Mutationen



Mutationen am Gen müssen in den Keimzellen entstanden sein, sonst wären sie nicht vererbbar. Keimbahnmutationen sind verbbar, für Evolution entscheidend.


  • Nullmutation: Ist der Ausfall einer Genfunktion (durch Deletion im Chromosom nachweisbar)

  • Neomorphe Mutation: Entstehung eines neuen Phänotyps auf Grund eines Allels mit abnormer Funktion. (Bein statt Antenne am Kopf)

  • Somatische Mutation: Eine Veränderung der genetischen Konstitution durch mitotische non-disjunction (Die Homologen trennen sich nicht und es entstehen anormale Keimzellen, ein paar mit 22 Chromosomen und der Rest mit 24. Wenn diese mit einer normalen Stammzelle verschmelzen entstehen Trisomien.) Entstehung von Gyander (halb männlich und weibich) bei Insekten. Nicht erblich da Einzelfall.


Punktmutationen am Nukleotid


Zwei Verschieden Arten der Substitution, d.h. eine Base wird gegen eine andere eingetauscht. Das Leseraster wird nicht verschoben:


  • Transition: eine Purinbase wird gegen eine andere eingetauscht oder eine Pyrimidinbase wird gegen eine andere eingetauscht


Substitution in codierenden Bereichen (Exons):


Nonsense-mutation: ein Stop-Codon wird erzeugt sodass die Synthese des Proteins an betroffener Stelle abbricht.

Missense-mutation: Veränderungen im Einbau von Aminosäuren, andere Aminosäure wird eingebaut.

Stille Mutation: Keine Auswirkung da die dritte Base meist vernachlässigbar ist.

Readthrough-mutation: Ein Stopp-Codon wird in ein Codon umgewandelt sodass die Proteinkette verlängert wird.


Insertionen (Rasterschub-Mutation)


Gewinn einer zusätzlichen Base. Die anderen Basen rücken in Leserichtung auf (rechts) somit wird das Leseraster verändert.

Deletion (Rasterschubmutation)


Verlust einer Base. Die anderen Basen rücken gegen die Leserichtung auf (links) somit wird das Leseraster verändert.


Chromosomenmutationen (Chromosomenaberration)


Ist die Veränderung der Zahl oder Struktur der Chromosomen


(Arten siehe Zeichnung)


Veränderung der Chromosomenzahl wird als Genommutation bezeichnet.


Haploidisierung ist die Reduzierung von einem diploiden Satz auf einen haploiden.

Aneupleudisierung ist das Fehlen oder Auftreten einzelner Chromosomen.


Unterscheidungen der Mutationen nach Ursache:


Spontane Mutation:

Haben keine äußere Ursache, wie der Zerfall eines Nukleotids oder der Tunneleffekt (Protonentunnel in der DNA)


Induzierte Mutation:

Wird durch ein Mutagen ausgelöst.

z.B. Strahlenbelastung

UV-Strahlung: Verfügt über nicht genügend Energie sodass nur Einzeller und Zellen an der Oberfläche betroffen sind. Bildet Thymindimere. Dimere ändern die Konformation der DNA. Durch C-C-Bindungen werden Cyclobutanringe gebildet die zur Aufhebung der Basenpaarung führen. Bei Pyrimidinbasen.

Ionisierende Strahlung (z.B. Röntgenstrahlung)

Es entstehen Radikale die Einzel- und Doppelstrangbrüche induzieren. Ersteres ist reparabel, Doppelstrangbrüche führen zu Chromosomenmutationen.


Reparaturmechanismen


Photoreaktivierung:


Bei Einzellern und Oberflächenzellen hervorgerufenen Mutationen durch UV.


Reparatur von Dimeren durch Photoreaktivierung. Das Enzym Photolyase bindet an das Dimer und Lichtenergie wird durch ein Chromophor gespeichert und dann auf ein weiteres übertragen. Dies führt zur Spaltung von Cyclobutanringen.



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