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Publikation zum Thema :


Citronsäureproduktion einer isolierten Aspergillus niger Kultur


Autor :

Einrichtung :

Brandenburgisch Technische UniversitätCottbus-SenftenbergGroßenhainer Str.57 01968Senftenberg

Abb. 1 ) Aspergillus niger auf BM .Medium


Fachbereich : Mikrobiologie

Eingereicht am : 07.01.2014


Abb. 2 )Sporenträger des Aspergillus niger

  1. Zusammenfassung

Schimmelpilze sind jedem bekannt, der einmal Brot oder andere Nahrungsmittel zu lange stehen gelassen hat .Sie können nahezu überall wachsen und


Zu Untersuchen war die Citronensäure-Produktion einer Aspergillus niger Kultur, welche durch ein spezifisches Screening-medium aus einer Bodenprobe isoliert werde. Nach einer Woche wuchs Pilzmycel auf der Flüssigkeitsoberfläche. Die Sporen konnten abgeschwemmt, auf eine Biomalzplatte aufgebracht werden.

Es folgte eine makroskopische und mikroskopische Analyse. Die Sporenträger wurden durch eine Färbung gut sichtbar. Im weiteren Verlauf wurde eine Kontrolle auf vorliegen einer Reinkultur durchgeführt. Ein Sporen-Inokulum von 107

Spore war durch Verdünnung und Auszählung mittels Zählkammer zu bestimmen. Angefertigt wurde eine Submers-Kultur. Ein Saccharose-medium wurde mit der ermittelten Anzahl an Sporen beimpft und für sieben Tage als Schüttelkultur kultiviert. Zum Nachweis der Produktbildung wurde die Probe zentrifugiert, so wie eine Ph-Wert Messung durchgeführt.

Die Bestimmung des Citronsäuregehaltes erfolgte darauf enzymatisch, über die Ermittlung der Umsetzung von NADH zu NAD. Mit den Messungen der Absorption konnte der produzierte Citronensäure -Gehalt quantitativ bestimmt werden.


  1. Abstract

The production of citric acid of a Aspergillus Niger culture which is isolated by a specific Screening-medium from a soil sample was to be examined .After one week grew a fungusmycel on the liquid surface. The spores could be washed away, be raised on a biology malt record.

It followed macroscopic and microscopic analysis. The spore bearers became well visible by a colouring. In the other course became a control on are given to a pure culture carried out. A spore inoculum of 107 was to be determined by thinner and counting up by means of countable chamber.

A submerged culture was made. A saccharose medium was cultivated with the ascertained number in spores toinoculate and for seven days as a agitate culture. To the proof of the product education the test was centrifuged, as well as a pH factor measurement was carried out.

The regulation of the content of citric acid occurred on it enzymatic, about the inquiry of the conversion of NADH to NAD. With the measurements of the absorption the produced the content of citric acid could be determined quantitatively.

  1. Einleitung

Ein wichtiger Vertreter ist der Schimmelpilz Aspergillus niger, der in jeden Haushalt vorzufinden, seine Sporen verbreiten sich durch leichteste Luftbewegungen im Raum. Er wird den Ascomyceten zugeordnet und ist als Gießkannen oder Schwarzschimmel bekannt. Seinen Namen hat der Pilz von seinen dunklen, fast schwarzen Sporen. Aspergillus niger ist ein im Erdboden weitverbreiteter Mikroorganismus.

Zu Beispiel ist mithilfe von molekularbiologischen Methoden die Produktion von Citronsäure mit dem Schimmelpilz A. niger möglich. Als ein Zwischenprodukt des Energiestoffwechsels (im Citrat-zyklus) ist Citronensäure ein wichtiger Bestandteil jeder lebenden Zelle. Der menschliche Stoffwechsel setzt am Tag ein kg Citronensäure um.

In der Lebensmittelindustrie ist Citronensäure das meistgebrauchtes Säuerungsmittel. Citronensäure wurde lange Zeit ausschließlich aus Zitronen hergestellt, das erste Patent zur Produktion durch Mikroorganismen wurde 1913 in den USA beantragt. Heute wird nur noch der Schimmelpilz Aspergillus Niger für die Citronensäureherstellung genutzt.

Man verwendet Überproduzenten, Mikroorganismen welche den gewünschten Stoff in großen Mengen synthetisieren und in die Nährlösung abgeben. Voraussetzung für einen hohen Ertrag ist das in verwendeten Nährmedium Eisenmangel herrscht.




    1. Mikrobiologisches Material :


  • isolierte Aspergillus niger –Kultur

Probe:

  • Art der Probe : Bodenprobe (vorwiegend Lehmboden)

  • Entnahmestelle : Oberhermsdorf

  • Datum der Probenahme : 02.11.2013


Geräte :

  • Spatel

  • Screening - Kolben ( 30 ml)

  • Sterile Glaspipette (10ml)

  • Impföse , Brenner , Feuerzeug

  • Mikroskop , Objektträger und Deckglas

  • Steriles Röhrchen

  • Zählkammer mit Deckglas

  • Schüttelkolben

  • Pipetten und Pipettenspitzen (100µl)

  • Zentrifugenröhrchen

  • Eppendorf- Gefäße

  • Küvetten und Rührstäbchen


Apparaturen:


  • Ph-Messgerät

  • Brutschrank : 28 °C

  • Schüttler

  • Zentrifuge ( 4500 xg )

  • Photometer


Chemikalien /Lösungen :

  • 3 ml sterile physNaCl

  • Sterile phys NaCl (+0,1%Trition)

  • Färbelösung : Baumwollblaulösung ( 85% Milchsäure )

  • Lösung 1 :0,5ml

  • Lösung2 :0,01ml

  • Destilliertes Wasser ( 0,9ml)


Medium :

Inhaltsstoffe

Menge

PH-Wert

Screening-medium

30 ml

Flüssiges Medium

Nicht autoklavieren

Tannin

Gluccose

K2HPO4

MgSO4 x 7 H2O

NaNO3

Malzextrakt


20 g/l

1 g/l

0,5 g/l

0,2 g/l

3 g/l

0,5 g/l

6,5

BM( Malz –Extrakt-Agar)

1 Platte

Malzextrakt

Aga

30g/l

20g/l

5,6

Saccharose-medium

50 ml

Flüssiges Medium

Saccharose

NH4NO3

KH2PO4

MgSO4


160 g/l

2 g/l

0, g/l

0,25 g/l

5,4

Tabelle 1 ) Nährmedien




Methoden

Tag 1, 05.11.2013: Selektion, Screening einer Bodenprobe

Tag 2 ,12.11.2013: Isolierung und Anlegen einer Reihkultur

Tag 3, 19.11.2013: Makroskopische und Mikroskopische Analyse

Tag 4 ,26.11.2013: Überprüfung der Reinkultur

Tag 5, 03.12.2013: Animpfen Submers-Kultur

Tag 6 , 10.12.2013 Messung der Produktkonzentration, Nachweis der Citronensäure-produktion


Ergebnisse:

In der untersuchten Bodenprobe wurde der Pilz Aspergillus niger nachgewiesen. Nach einer Woche wuchs dichtes, sporulierendes schwarzes Pilzmycel, auf der Oberfläche des selektiven Screening (Tanninin) –Mediums. Ebenfalls war auf der Biomalzplatte nach einwöchiger Kultivierung ein Wachstum des Pilzes zu beobachten.

Die Kontrolle ob eine Reinkultur vorliegt war positiv, es lagen keine Kontamination mit anderen Mikroorganismen vor.


Makroskopische Beobachtungen:

Die angefärbten Sporen und Sporenträger des Aspergillus niger waren zu erkennen. Differenziertes Pilzmycel konnte beobachtet werden.

Bei 400 facher Vergrößerung waren die für Aspergillus typischen kreisrunden auffälligen, Konidio –Sporen /Konidio Sporenträger zu sehen.

Konidophoren

Abbildung 1) handgezeichnete Skizze der Sporenträger des Aspergillus niger aus der Mikroskopischen Betrachtung des Aspergillus niger bei 400 fache Vergrößerung


Bei einer Kultivierung bei 28 °C bildet Aspergillus niger auf Festmedien nach wenigen Tagen Kolonien.

mit einem Durchmesser von ca. 2,5–5,0 cm. Innerhalb von 2–3 Tagen entstehen am Myzel Fußzellen, aus denen Konidienträger mit einer Höhe von 1,5–3 mm hervorgehen. An den Konidiophoren entstehen Metulae und Phialiden, welche ihrerseits Ketten von Konidiosporen abschnüren (Abb. 2.6). Die schwarzen Konidien besitzen einen Durchmesser


Sporen von Aspergillus niger überstehen feuchte Kälte bei –22 °C nicht. Der pH-Bereich liegt zwischen 1,5 – 9,8. Dieser Schimmelpilz ist also in der Lage, sowohl stark saure als auch alkalische Umgebungen zu tolerieren. Aspergillus niger ist ein xerophiler, d. h. trockenheitsliebender Pilz. aspergillus niger kann die Schimmelpilzgifte (Mykotoxine) Oxalsäure und Kojisäure bilden. 

/


Abb. 2 )Sporenträger des Aspergillus niger



Anzahl an Sporen

Mittelwert

1

85


2

90


3

88

22,05 * 106

4

87

=2,2 *107

5

91


Tabelle 3 ) Auszählung der Sporen


Erscheinungsbild des Submers - Emers- Wachstums im Schüttelkolben :

Bräunlich, dunkle Pellets waren auf der Oberfläche des flüssigen Saccharose-Mediums zu erkennen

Anzahl : viele

Größe : winzige

Form : rundlich

Es wurde ein PH-Wert von 2,25 gemessen. Vergleichswert ; PH:



1. Messung :

2 . Messung:


1 Vergleichsmessung

2

Vergleichsmessung

A1

1,491

1, 475



A 2

1,331

1,329



Ergebnis Citronsäure- Gehalt

0,00736 g/l

0,006716 g/l



Mittelwert

0,007038 g/l




Tabelle 3 ) Ermittelter Absorptionswerte und Berechneter Citronsäure- Gehalt


Aspergillus niger , dargestellt in Abbildung (3) ist ein in kurzer Zeit schell , gut wachsener Mikroorganismus.

Die Anzahl der gebildeten Sporen und der Gehalt an Citronsäure der produziert wird sind von der Pilzkultur abhängig.

Die Zählung der Sporen konnte nur einmalig durchgeführt werden, weshalb der ermittelte Wert abweichen und das verwendete Volumen ungenau sein kann. Was auch eine Ursache für die geringe Absorption, den geringen ermittelten Citronensäuregehalt sein kann.


Abbildung 3 )Bewachsene Platte (Aspergillus niger )


Vergleich mit den Werten von … :

Vergleich mitdem Laborstamm


Literaturverzeichnis :

  • Skript


Bilderverzeichnis :


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