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Biotechnologie schwab nidetzky Fragenausarbeitung

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Process engineering

University, School

Technische Universität Graz - TU

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Fragenausarbeit­ung­ Fragen Kapitel 2 1. Beschreiben Sie in Stichworten die Wachstumsperfor­man­ce der Industrieländer im letzten Jahrhundert anhand der Gesamt- und Pro-Kopf-Einkom­men­szahlen! ü Seit Beginn der Neuzeit: Wachstum in West- und Mitteleuropa und Nordamerika ü Wirtschaftswach­stu­m zwar schwankend, aber ständig wachsend (trotz Weltkriegen) ü Wirtschaftliche Entwicklung im 2. Jahrtausend seit Christi Geburt viel besser als im 1. ü Wachstum der Weltbevölkerung zwischen 1000 und 1998 um das 22-fache…
2. Rationales Screening und Selektionsverfa­hre­n Gezielte, auf biochemischem/g­ene­tischem Wissen basierende Verfahren • Isolierung gezielter Stoffwechselmut­ant­en • Reportersysteme •Wachstumsvorte­i­l von gesuchten Mutanten • Genomics – Proteomics – Metabolomics 4. a. Einsatz der Hefe in der Biotechnologie + Produkte nennen. b. Wofür werden isolierte Enzyme verwendet + zu jedem Bereich Beispiele an Enzymklassen nennen. Enzyme in Lebensmittelanw­end­ungen Kohlenhydrat-mo­dif­izierend­e Enzyme…

Einfuhrung• in die Biotechnologie Ausarbeitung der Prufungsfragen•


,


14. April 2016


1 Fragen


1.1 Verlauf und Phasen einer Batch-Kultur, erkl•aren und zeichnen


In einer Batch-Kultur gibt es verschiedene Wachstumsphasen.


Lag-Phase (Anlaufphase): Hier setzen Regulationsprozesse ein. Die Mikroorganismen (MO)gewohnen• sich an das Medium und zu einer Zunahme der Biomasse kommt es kaum. Zu einer Beschleunigung des Wachstums kommt es, wennn sich die MO auf das Medium eingestellt haben.


Log-Phase (exponentielle Phase des Wachstums): Hier vermehren sich die Zellen mit konstanter und maximaler Rate max. Es ergibt sich eine halblogarithmische Dar-stellung einer Geraden aus der sich die Wachstumsrate berechnen lasst•. die Wachs-tumsrate ist spezi sch fur• Substrat und Temperatur. Die Log-Phase schreitet solange voran, bis das Substrat verbraucht ist.

Die spezi sche Wachstumsrate hangt• von dem Substrat, der Konzentration und den Sto wechselwegen in den Bakterien ab.


Stationare• Phase: Hier ndet kein Wachstum mehr statt, Die Zellen stellen sich auf eine Hungerperiode ein.


Absterbephase: Die Anzahl der lebenden Zellen nimmt exponentiell negativ ab. Dies erkennt man wenn man die Kultur uber• einen langeren• Zeitraum betrachtet.


Abbildung 1.1: Verlauf und Phasen einer Batch Kultur


X .Zelldichte; S .Substratkonzentration; .spez. Wachstumsrate


2


  1. Spezi sche Wachstumsrate bei Substratlimitierendem Wachstum, mathematische Modelle + einzelne Parameter erkl•aren


Substrat-limitiertes Wachstum (Monodkinetik):


Das Mathematische Modell ist die Monodkinetik zum Vorhersagen des Wachstums von MO in Abhangigkeit• von der Konzentration der Substrate. Die spezi sche Wachstumsrate

nahert• sich mit zunehmender Substratkonzentration max. Die spezi sche Wachstumsrate


steht im Zusammenhang mit der Konzentration des limitierenden Substrates S. Sofern keine Inhiebierung vorliegt und die Substratkonzentration sehr gro ist (S > Ks), wird die maximale Wachstumsgeschwindigkeit max erreicht. Die Sattigungs•- oder A nitatskon•-stante (Ks) ist die Substratkonzentration bei der = 12 max (es lauft• bei halbmaximaler Geschwindigkeit) betragt,• je kleiner der Ks Wert umso gro• er die A nitat•.


= max


S

(1.1)



S + KS


dS

1


X




=



(1.2)


dt

Yx/s


YX/S =

X X0

(1.3)

S0 S






Mit


= spezi sche Wachstumsrate max = maximale Wachstumsrate S = Substratkonzentration


Ks = Substratkonzentration, die Wachstum mit halbmaximaler Rate ermoglicht• (klei-ner Ks = hohe A nitat• des Organismuses zum Substrat (besser))


YX/S = Ertragskonstante X = Biomasse


  1. Strategien zum Filtern geeigneter St•amme nach Zufallsmutagenese


Alle einzelnen Individuen einer Population werden getestet; individuelle Auslese, zeitauf-wendig (hoher Durchsatz an Klonen), man braucht geeignete analytische Verfahren; kann automatisiert werden


  1. Individuelle Auslese


Hoher Durchsatz { high throughput geeignete analytische Verfahren


Automatisierung


3


Methoden: Schuttelkolbenverfahren,• Plattentest auf Einzelkolonieebene, Mikrotiter-plattenverfahren, Verfahren auf Einzelzellebene - FACS (Fluresenz Angeregtes Zell Sortieren)


    1. Rationales Screening und Selektionsverfahren


Gezielt, auf biochemischem/genetischem Wissen basierende Verfahren


Isolierung gezielter Sto wechselmutanten Reportersysteme


Wachstumsvorteile von gesuchten Mutanten Genomics- Proteomics- Metabolomics


  1. Methoden zur Bestimmung der Biomasse - Vor- und Nachteile?


Wachstum lasst• sich durch die Bestimmung der Biomasse (Trockensubstanz) oder Zellzahl


(N) beschreiben. Die beiden Gro• en korrelieren nicht notgedru.....[read full text]

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Aus dem linearen LLD-Tripeptid wird dann durch eine Cyclisierung in 2 Schritten Isope-nicillin N (IPN) gebildet. Dieses IPN ist der Verzweigungspunkt der Biosynthesewege zum Penicillin und Cephalosporin.


Bei der Penicillin Biosynthese wird die hydrophile Seitenkette gegen eine hydrophobe Acylgruppe ausgetauscht und es entsteht Penizillin-G.


Bei Cephalosporin Synthese wird die Seitenkette katalysiert und zum Penicillin N.Daraus entsteht durch eine Ringerweiterung, Oxidation der Methylgruppe und Acetylierung der Hydroxygruppe Cephalosporin C.


Zusammenhang: Cephalosporin und Penicillin gehoren• beide zu den Aminosaure• und Peptid Antibiotika sowie zur gleichen Untergruppe der beta-Lactam-Antibiotika und sie inhibieren die Biosynthese der bakteriellen Zellwand.


1.8 Biotransformationen: Erkl•aren Sie den Begri und geben Sie ein Beispiel


Sto umwandlungen mit Hilfe von biologisch aktiven Zellen, Ausgangsmolekule• werden in das biologische System eingebracht und neue Produkte entstehen aus de nierten Reaktio-nen.


Vorteile:


Hohe spezi titat• (dem Substrat gegenuber• und das Enzym katalysiert nur eine spe-zi sche Reaktion) und selectivitat•


milde Reaktionsbedingunen (Temperatur, Druck, pH-Wert). Biotransformationen sind billiger als chemische Synthesen Naturlich• Abbaubare Komponenten werden produziert


6


Bsp: Herstellung von Cortison aus Stigmasterol von Sojabohne (ine zient): Stigmasterol wird uber• 4 chemische Schritte zu Progesteron. Progesteron wird uber• das Zwischenprodukt 11-alpha-Hydroprogesteron durch weitere chemische Schritte zu Hydro-cortisol und schlussendlich uber• weitere chemische Schritte zu Cortison.


  1. Wie h•angt das Wachstum von Mikroorganismen von der Temperatur ab? Erkl•aren Sie anhand der Formel


Bei zu hohen Temperaturen kommt es zur Denaturierung von Proteinen oder zum absterben der Biomasse, daraus folgend zu einer Reduktion.


dX

= X X = Zuwachs Absterben

(1.5)

dt

= spezi sche Absterberate und diese ist Temperaturabhangig•. = spezi sche Wachstumsrate und diese ist Temperaturabhangig•. X = Biomasse


Abbildung 1.3: Temperaturabhangigkeit• des Wachstumsverhaltens


1.10 Was verstehen Sie unter Biokatalyse? Geben Sie ein konkretes Beispiel dafur•.


Biokatalyse ist der Einsatz von Enzymen zur Synthese oder Modi kation von chemischen Molekulen•.


z.B.: Verwendung von naturlich• vorkommendem HNL (Hydroxynitrile Lyase) zur Produk-tion von Cypermethrin.


Vorteil der Biokatalyse:


Hohe Substratspezi tat• (gegenuber• chem. Synthese) Hochreine Feinchemikalien konnen• gewonnen werden


Einsparung von Energiekosten durch Senkung der Reaktionstemperatur Biokatalysatoren selbst sind biologisch abbaubar


Deutliche Reduktion von schadlichen• Abwasserinhaltssto en


7


  1. Vergleich (in biotechnologischer Hinsicht) von verschiedenen Produktionssystemen: Prokaryonten und tierische Zellkultur: Was sind jeweils die Vor- und Nachteile?





Bakterien


Tierische Zellen






Kompartimentierung


keine


ja (Eukaryont)



Gro• e


1-5 m


sehr variabel

Mechanische Belastbar-


hoch


sehr gering

keit







Form: Kugel /

Stabchen•

Suspensionskulturen

Merkmale


/Spirelle-Beweglichkeit



(Geiseln)









Sporenbildung


Adhasion• an Ober •ache



Zellwandaufbau

(Gram-

Zellwand: keine



Farbung)•



Sauersto bedarf


aerob / anaerob


aerob (CO2)

Wachstum


Teilung td = 0; 2 1h

langsam, Teilung td 10h

Wuchssto bedarf


gering


hoch => komplexe Medien

Kultivierung


einfach


aufwandig• (minimale Scher-





krafte)•

Vorteile


hohe Sto wechselaktivitat•

konnen• komplece post-




translationale Modi katio-









nen durchfuhren•



gro e metabolische Diversi-

gute sekretorische Expressi-



tat•


on







  1. Erkl•aren Sie den grunds•atzlichen Aufbau von biologischen Membransystemen. Erl•autern Sie weiters die wichtigsten Systeme zum Transport von Molekulen.....

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Anaerobe Atmung: Ausgangsmaterialien sind Organische Komponenten (C-Quelle fur• CO2). Fur• die Oxidation wird anstelle von O2 alternative Elektronenakzeptoren verwen-det (S, NO3-, SO4 oder organische Elektronenakzeptoren). Es wird ein Protonengradient erzeugt und durch die ATP-Synthase wird Energie in Form von ATP gewonnen.


Chemolithotropher Metabolismus: Bei chemolithotrophen Lebewesen erfolgt der Ener-giegewinn chemisch durch den Abbau anorganischer Verbindungen, sie stellen das Reduk-tionsmittel dar Energiebedarf wird aus exergonen Sto umsetzungen gedeckt (Chemotro-phie).


Der Aufbau von Zellverbindungen stammt hier aus den Zwischenprodukten des Abbaus anorganischer Verbindungen. Als C-Quelle dient CO2 aus der Luft, der durch den Calvin-Zylkus xiert wird. Die Energie stammt aus inorganisch reduzierten Materiallien durch Oxidation und ATP synthese gewonnen.


Phototropher Metabolismus: Licht wird als Energiequelle benutzt• um ATP zu synthe-tisieren. Licht wird durch Chlorophyll oder Rhodopsin aufgenommen wodurch der Proto-nengradient erzeugt wird und NADPH und ATP erzeugt wird. CO2 wird xiert uber• den Calvin-Zyklus. Dabei dient CO2 als Kohlensto quelle.


1.16 Erl•autern Sie die wichtigsten historischen biotechnologischen Abschnitte: welche Entdeckungen wurden darin gemacht?

Pra•-Pasteur-Ara (vor 1865): Unbewusste Nutzung von MO bei der Nahrungsmittel-


herstellung (Garung:• Wein, Bier, Essig, Kase)•

Pasteur-Ara (1865-1940): Verfahren ohne absoluten Ausschluss von Fremdkeimen


(Fermentation, Ober achenkultur,• Biomasse (Backerhefe))•

Antibiotika-Ara (1940-1960): Steril Technik und selektionierte Stamme• (Penicillin,


.....

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  1. Prozessentwicklung: Im Bioreaktor (dient zum kultivieren unter konstanten Bedin-gungen. Dabei gibt es 3 Prozesse


Upstream Prozesse : Es kommt zur Medienaufbereitung, Sterilisation und Impf-gutherstellung Hier lasst• man MO/Zellen in Bioreaktoren wachsen und es wird Wachstumsmedium, Wachstumskinetik optimiert sodass der Umsatz erhoht• wer-den kann


Nebenprozesse: Kuhlsysteme,• Luftversorung, Lagerhaltung (sind dafur• verant-wortlich, dass die konstanten Bedingungen die fundamental sind aufrechterhal-ten werden)


Downstream Prozesse Hier wird die Zellmasse des Upstream Prozesses verarbei-tet um Reinheits und Qualitatsbedingungen• zu erfullen•.


{ Zellabtrennung (Filtration bei Pilzen oder Zentrifugieren bei MO) { Zellaufschluss (Hochdruckhomogenisator)


{ Produktisolierung { Produktreinigung


{ Konfektionierung (wenn das Produkt in der Zelle ist muss sie aufgebrochen werden)


11


1.18 Signaltransduktion erkl•aren + zeichnen


Ist ein Prozess an der Zellwand, um Signale ans Zellinnere weiterzuleiten um auf au• ere Reize reagieren zu konnen•.


Z.B.: Genexpression oder Sto wechselregulation


Abbildung 1.4: Signaltransduktion


  1. Nennen Sie die wesentlichen funktionellen Komponenten des Expressionsvektors pMS4708


Promotor (RNA-Polymerase bindet zuerst hier)


Operator (reguliert die Transkription)


Terminator (Transkription stoppt)


Pra•-/Signalsequenzen (fur• Export von Protein aus Zelle)


Selektionsm.....

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Primarsto• wechsel: Aminosauren,• Alkohol, Zucker


Sekundarsto• wechsel: Komplexe Metabolite (Antibiotika, Peptide


  1. Beschreiben sie die industrielle Nutzung der B•ackerhefe. Welche Produkte werden mittels dieses Pilzes in biotechnologischen Prozessen gewonnen?


Biomasse: Futter, Lebensmittelerganzung,• Tierfutterung•


Zellinhaltssto e/Enzyme: B Vitamine, Vitamin D, Enzyme fur• die Lebensmittelindus-trie, Hefeextrakt als Nahrmedium•


Fermentationsprodukte aus Hefe: Ethanol (Industriealkohol oder Lebensmittelalko-hol), Glycerol


  1. Bedingungen fur• steriles Arbeiten


Sterile Kessel, Werkzeuge, Dichtungen - Sterilisation durch Sattdampf Sterile Zudosierung und Probennahme - Filtration


Abtoten• aller enthaltenen / anhaftenden Mikroorganismen


13


  1. Erkl•aren Sie die grundlegenden Funktionsweisen der positiven und negativen Kontrolle der Genexpression (z.B.: am Beispiel des Laktose Operons von E.Coli). Zeichnen sie Schemata in denen die wesentlichen Komponenten dargestellt sind und beschreiben sie wie diese funktionieren.


Negative Kontrolle durch Induktion: Vor dem lac Operon ist das LacI Gen, es ist nicht Teil des lac Operons. Das Gen fur• den Lac Repressor (aktiver Repressor) wird unab-hangig• vom Lac Operon oder von den Wachstumsbedingungen transkribiert (konstitutive Transkription). Der Repressor bindet an der Operatorregion und blockiert die RNA Pol. Durch die Bindung eines Inducers (Allolactose) an den Repressor (lac Repressor), wird dieser inaktiviert wodurch die Transkription der RNA Pol statt ndet und eine mRNA fur• das Operon gebildet wird.

Im Fall des lac Operons ist der Repressor der lac Repressor und der Ind.....

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14


2 Fragen


2.1 Prozess zur Gewinnung von Glucose aus St•arke - welche Enzymsysteme sind beteiligt?


-Amylase: Spaltet die -1,4-glycosidische Bindung


-Amylase: Spaltet vom kettenende 1 Maltosemolekul• ab Isoamylase: Spaltet die 1,6-glycosidische Bindung -Amylase: Spaltet Glucosemolekul• von Kette ab


Glucose-Isomerase: verwandelt bei 60oC Glucose in Fructose und bei 30 oC Fructose in Glucose.


  1. Grundlegende Einheitsoperationen industrieller Bioprozesse


Vorbehandlung der Substrate


Substrat wird in das Fermentationsmedium eingebracht. Dabei muss pH, H2O, Ma-kronahrsto• e und Durchmischung schon stimmen

Sterilisation der Mischung


Beimpfung mit Mikroorganismen die zu einer Fermentation fuhren• Trennung der Biomasse und Kultur ussigkeit•


Isolierung des Produktes mit Reinigung Endprodukt.


  1. kLa Wert: Wie kann er erhoht• werden


kL ist der Massentransportkoe zient der Flussigphase,• a ist die Gas-Flussig• Austausch a•-che pro Volumseinheit. kLa-Wert kann durch


die Gro• e und Verweilzeit der Gasblasen (Art der Begasungseinheit; Ruhrer• und Ruhrspitzengeschwindigkeit)•


Leistungseintrag (Art und Geometrie des Ruhrers;• Ruhrerdrehzahl• b.....

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