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VERGLEICH VERSCHIEDENER MESSVERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DES ZELLTODES VON HEFEZELLEN Der Eukaryot Saccharomyces Cerevisiae ein Modellorganismus in der molekularbiologischen Forschung. Aufgrund der einfachen Kultur-bedingungen und der Verwandtschaft der internen Zellstruktur zu anderen eukaryoten Zellen wird er zum Beispiel zur Untersuchung des Zellzyklus oder des Proteinabbaus verwendet. Der Zelltod., die sogenannte Apoptose, ist eine Form des programmierten Zelltods. Es ist gewissermaßen ein „Zellselbstmord“ einzelner Zellen. Die Apoptose wird aktiv von der Zelle durchgeführt und ist somit Teil des Stoffwechsels der Zelle, wodurch die Zelle einer strengen Kontrolle unterliegt und ohne Schädigung des benachbarten Gewebes stirbt. Dieses kann von außen angeregt werden (etwa durch Immunzellen) oder aufgrund von zellinternen Prozessen ausgelöst werden (etwa nach starker Schädigung der Erbinformation). Die Apoptose unterscheidet von den anderen Formen des programmierten Zelltods, das bei ihr eine Gruppe von Enzymen, die proteolytische Aktivität aufweisen, durch sogenannte Caspasen, eine zentrale Rolle spielen.
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auch benachbartes Gewebe beschädigt wird. Im Vergleich zur Nekrose ist die
Apoptose die häufigere Form des Zelltods. im Zusammenhang mit der Krebsentstehung und verschiedenen Autoimmunerkrankungen erforscht. Ein Ziel der Krebsforschung ist es, kontrollierte Apoptose bei entarteten Zellen auszulösen. METHODENDas Sterben von einzelnen Hefezellen kann über mehrere Verfahren bestimmt werden: 1) FACS-Analyse Bedeutet Fluorescence Activated Cell Sorting, wird aber meist Durchflußzytometrie genannt. Es wird anhand optischer Signalen die Intensität der Emissionen der Zelle gemessen wenn diese den Lichtstrahl passiert. Der Schwellenwert, ab dem eine Zelle als tot betrachtet wird, kann frei gewählt werden. Fluoreszenz Mikroskopie: DHE (Dihydroethidium) ist eine Färbung zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezien (z.B. H2O2). So wird Zellstress nachgewiesen. Es werden die toten Zellen positiv fluoreszierend gezeigt, weil die Fluoreszierende Farbe das Mikroskop abgegebene Licht reflektiert. Im Fluoreszenz-Mikroskop erscheinen DHE- positive Zellen rot fluoreszierend. Dies ist der Anteil der gestressten Zellen, die aktiv Selbstmord begehen. DIC (Digitaler Interferenzkontrast) ist die Hellfeldmikroskopie. Sie zeigt die gesamte Population sowohl lebende als auch tote Zellen. 2) Tunel-Methode,
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Im Vergleich der beiden Färbemethoden mit ungleichen Varianzen am Tag 1 ergibt sich eine Wahrscheinlichkeit p von 5,07088*10-34, der kleiner als das Signifikanzniveau ist und somit kann die H0 Hypothese verworfen werden. Es kann also ein signifikanter Unterschied bei den beiden Färbemethoden betrachtet werden.
Um die verschiedenen Mikroskop-Ergebnisse gegenüber zustellen, wurden die Bilder bearbeitet (Bild 9, 10, 11, 12) und die lebenden und die toten Populationen übereinandergelegt um so diese zu vergleichen und auszuzählen. Wenn man die verschiedenen Prozentsätze (Bild 13, 14, 15, 16) der Populationen der Fluoreszenzmikroskopie DHE Tag 1 und Tunel Tag1 erhält man einen 6-mal so großen Unterschied bei den toten Zellen.
Es ergibt sich ebenso ein Unterschied bei der Fluoreszenz-Mikroskopie DHE Tag 5 und Tunel Tag 5.
Ein Grund für die Unterschiede in den einzelnen Färbemethoden kann die genommene Stichprobe sein, da diese nicht für alle 26000 Intesitätswerte stehen kann.
ERGEBNISSE
Aufgrund der Auswertung wird festgestellt, dass der Vergleich von FACS-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie schwierig ist, da jedes der beiden Verfahren eine eigene Technik und verschiedene Daten beinhaltet.
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Aufgrund der Stichproben kommt es aber zu extremen Abweichungen der Ergebnisse, daher müsste man vermutlich, um ein genaueres Ergebnis zu erzielen, alle 26000 Intensitätswerte bei FACS verwenden. Bei Fluoreszenzmikroskopie wären Bilder mit größeren Populatiuonen aussagekräftiger.
In diesem Fall gibt es somit keinen direkten Vergleich.
REFERenzen
1. Univ.-Prof. Dipl.-Ing. Dr. Siegfried Vössner, Skriptum EDV Basiswissen
2. http://de.wikipedia.org/wiki/Apoptose
3. http://de.wikipedia.org/wiki/Facs
4.
http://de.wikipedia.org/wiki/Fluoreszenzmikros
TABELLEN UND Bilder
Tabelle 1: Median, Mittelwert, Varianz
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