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Tierphysiologisches Praktikum - Exkretion .doc

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Biomedical Sciences
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Tierphysiologisches Praktikum

Protokoll vom 18.11.08

Exkretion

1. Einleitung

Unter der Exkretion versteht man das Entfernen von nicht mehr verwertbaren Stoffwechselprodukten aus dem Stoffwechselkreislauf. Der Begriff Exkretion kommt aus dem lateinischem von: externere und bedeutet “ausscheiden”.

Beim Abbau von Aminosäuren und Nukleinsäuren fallen für den Organismus toxische Endprodukte, wie Ammoniak, Harnsäure, Harnstoff und Kreatinin an, weshalb diese Exkretionsvorgänge essentiell sind.

Man unterscheidet die verschiedenen Formen der Exkretion nach dem Endprodukt das der Organismus bildet.

Ist das Endprodukt Ammoniak wird sie als Ammoniotelie, bei Harnstoff als Ureotelie und bei Harnsäure als Endprodukt als Uricotelie bezeichnet. Die betreffenden Organismen nennt man dementsprechend Ammoniotelier, Ureotelier und Uricotelier.

Die Niere ist das Hauptexkretionsorgan der Säugetiere, deren exkrtorische Einheit das Nephron darstellt, welches hinein Blutkapillarknäul, den Glomerulus und ein anschließendes Tubulussystem unterteilt ist.

Der Glomerulus ist von der Bowman-Kapsel umschlossen, in der die Ultrafiltration des Blutes zum Primärharn statt findet.

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Der schließlich abgegebene Urin umfasst lediglich ein Hundertstel des ursprünglichen Volumens des Primärharns und ist wesentlich konzentrierter an Exkretionsprodukten.

Zur Überprüfung der Nierenfunktion eignen sich nur solche Stoffe, die bei der Ultrafiltration ungehindert in das Tubulussystem hineingelangen und im Folgenden weder resorbiert noch sezerniert werden und somit im Urin zwar konzentrierter aber in unveränderter Menge vorliegen.

Das natürlich im Körper vorkommende Kreatinin, welches im Muskel entsteht und das in der Medizin verwendete, künstlich dem Körper zugeführte Insulin eignen sich hierfür besonders gut.

Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) lässt sich mit Hilfe dieser Stoffe bestimmen, welche die Menge des pro Zeiteinheit gebildeten Primärharnvolumen beschreibt. Außerdem lässt sich das Maß für die Reinigung des Blutes von einer Substanz pro Zeiteinheit bestimmen: die Clearance.

Bei einer gesunden Niere entspricht der Clearancewert bei Insulin und Kreatinin 125 ml/min. dem GFR.

Aufgaben:

1. Kreatininbestimmung: Bestimmung der Konzentration und der GFR

2. Harnstoffbestimmng: Bestimmung der Konzentration und der GFR

3. Harnsäurebstimmung: Bestimmung der Konzentration

2. Materialien und Methoden

 

2.1. Kreatininbestimmung

 

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Proben und Reagenzien:

- Pikrinsäure 25 mmol/l

- NaOH 0,2 mol/l

- Creatinin-Standard-Lösung 2mg/dl bzw. 177 µmol/l

- Proben: Dozentenserum (unverdünnt), TV: 1,5l

Dozentenurin (1:50 verdünnt), TV: 1,5l

Eigenurin (1:50 verdünnt)

2.1.2.

Testansatz:

- Leerwert: mit 200µl Pikrinsäure, 1000µl NaOH, 40µl dest. Wasser

- Standard: mit 200µl Pikrinsäure, 1000µl NaOH, 40µl Standard-Lösung

- Probe Serum: mit 200µl Pikrinsäure, 1000µl NaOH, 40µl Probe

- Probe Dozentenurin: mit 200µl Pikrinsäure, 1000µl NaOH, 40 µl Probe

- Probe Studentenurin: mit 200µl Pikrinsäure, 1000µl NaOH, 40 µl Probe

à mischen, 20 min. bei Raumtemperatur inkubieren

2.1.3.

Durchführung:

Bei diesem Versuch ging es darum die Kreatininkonzentration und die GFR, bzw. die Clearance zu bestimmen. Zunächst wurde der Testansatz wie oben beschrieben angesetzt und 20 min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurden die Extinktionen am Photometer gegen den Leerwert bei einer Wellenlänge von 492nm gemessen.

2.2. Harnstoffbestimmung

2.2.1

Proben und Reagenzien:

- Urease (gepuffert: Urease, Phosphat-Puffer) ­³ 10U/ml (Urease, Sigma 94285)

- Harnstoff-Standard-Lösung 3mg/dl bzw. 0,50 mmol/l

- Proben: Dozentenserum (1:10 verdünnt)

Dozentenurin (1:1000 verdünnt)

Studentenurin (1:1000 verdünnt mit Verdünnungsreihe 1:10 Þ 1:10 Þ1:10)

Kücken (1 Tag, 10 und 20 Tage alt, 1:50 verdünnt)

- Phenol-Reagenz (Phenol 106mmol/l, Natrium-Nitroprussid 0,17mmol/l)

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2.2.2

Testansatz:

- Leerwert: 50 µl Urease, 50 µl dest. Wasser

- Standard: 50 µl Urease, 50 µl Standard-Lösung

- 6 x Probe: 50 µl Urease, 50 µl Probe

à Röhrchen verschließen, vorsichtig mischen und 20 min. bei 37°C inkubieren

- auf alle Röhrchen jeweils noch 500µl Phenol- und 500µl Hypochlorit-Reagenz

à sofort mischen und 15 min. bei 37°C inkubieren, abkühlen lassen

2.2.3.

Durchführung:

Bei diesem Versuch ging es darum den Harnstoffgehalt und die Clearance zu bestimmen. Zunächst wurde der Testansatz wie oben beschrieben angesetzt, vorsichtig gemischt und 20 min. bei 37°C im Thermobecken inkubiert. Anschließend wurden die restlichen Reagenzien den Röhrchen zugeführt und nochmals 15 min. bei 37°C inkubiert.

Zum Schluss wurde die Extinktionen am Photometer gegen den Leerwert bei einer Wellenlänge von 546nm gemessen.

2.3. Harnsäurebestimmung

2.3.1

Proben und Reagenzien:

- Reagenzlösung (Phosphatpuffer 0,05mol/l, pH7,8, TOOS 7mmol/l, Ascorbat-

Oxidase ³5U/ml, Detergenz 48g/l

- Harnsäure-Standard-Lösung 5,37mg/dl

- Proben: Kückenkot (1 Tag, 10 und 20 Tage alt, je 500mg in N NaOH gelöst und

1:50 verdünnt)

- Startreagenz (Phosphat-Puffer 0,1mol/l, pH 7,8, Kaliumhexacyanoferrat II

300µmol/l, 4-Aminophenazon 5mmol/l, Peroxidase ³1U/ml, Uricase

³0,5U/ml)

 

2.3.2.

 

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- Leerwert: 1000µl Reagenz-Lösung, 40µl dest. Wasser

- Standard: 1000µl Reagenz-Lösung, 40 µl Standard-Lösung

- Kücken-Proben: 1000µl Reagenz-Lösung, 4µl Probe

à gut mischen, 5- 10 min. bei 20°C inkubieren

- auf alle Röhrchen jeweils noch 200µl Startreagenz

à mischen, 5 min. bei Raumtemperatur inkubieren, mischen

2.3.3.

Durchführung:

Bei diesem Versuch ging es darum den Harnsäuregehalt zu bestimmen. Zunächst wurde der Testansatz wie oben beschrieben angesetzt, gut gemischt und 5- 10 min. bei 20°C inkubiert. Anschließend wurde das letzte Reagenz den Röhrchen zugeführt und nochmals 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert und zum Schluss, nach erneutem mischen die Extinktionen am Photometer gegen den Leerwert bei einer Wellenlänge von 546nm gemessen.

3. Ergebnisse

3.1. Kreatininbestimmung:

Zunächst wurde der Testansatz wie oben beschrieben angesetzt und 20 min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wurden die Extinktionen am Photometer gegen den Leerwert bei einer Wellenlänge von 492nm gemessen.

3.1.1.

Tabelle 1

Testansatz: Kreatininbestimmung

 

Standard

Serum

Urin Doz.

Urin Stud.

Extinktion

0,059

0,029

0,071

0,053

Konzentration

/

0,98mg/dl

120,0mg/dl

89,83mg/dl

GFR

/

/

183,7ml/Tag

137,49ml/Tag

3.1.2.

Berechnungen:

Konzentration der Urinproben mit der Formel unter Berücksichtigung der Verdünnungen:

Konz. Probe : Ext. Probe = Konz. Standard : Ext. Standard

 

Serum: 0,029 * 2mg/dl : 0,059 = 0,98mg/dl

à Das Serum hat eine Konzentration von 0,98mg/dl.

Dozent: 0,071 * 2mg/dl : 0,059 * 50 = 120,0mg/dl


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